Gregor Grass

Molekulargenetische und biochemische Charakterisierung der cnr Cobalt/Nickel-Resistenz-Determinante aus Ralstonia metallidurans CH34

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt an der Mathematisch-Naturwissenschaftlich-Technischen Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 05.06.2000

Abstract
Die protonengetriebene Nickel/Cobalt-Resistenz aus Ralstonia metallidurans CH34 wird durch die cnr-Determinate kodiert, die auf dem Megaplasmid pMOL28 kodiert ist. Durch Primer-Extension wurden zwei mRNA-Startpunkte bestimmt und daraus die Promotoren cnrYp und cnrCp der Operons cnrYXH bzw. cnrCBA abgeleitet. Mittels einer geeigneten lacZ-Operon-Fusion konnte die halbmaximale Aktivierung des cnrCBA-Operons durch 50 ÁM Ni2+ bestimmt werden. Das CnrH-Genprodukt, das für die Expression beider Operons benötigt wird, gehört zur Familie der SigmaE-Familie. In in vitro Transkriptionsexperimenten konnte seine Spezifität zu den Promotoren cnrYp und cnrCp nachgewiesen werden. Die CnrH-Aktivität wird durch das membrangebundene CnrY- und das CnrX-Genprodukt in Antwort auf Ni2+ reguliert. Das periplasmatische Sensor-Protein CnrX bindet 3 Ni2+ pro Polypeptid-Kette.
Mittels des Yeast-Two-Hybrid-Systems konnte eine Interaktion zwischen dem periplasmatischen Sensor-Protein CnrX und dem Transmembranprotein CnrY nachgewiesen werden. CnrX funktioniert möglicherweise als Protease mit Spezifität für CnrY, jedoch ist das Glutamat im Motiv HEXXH in CnrX nicht essentiell für die CnrX-Aktivität. Schließlich wurde gezeigt, dass der mit CnrYX-verwandte Anti-Sigma-Faktor-Komplex NccYX aus Achromobacter xylosoxydans 31A die CnrH-Aktivität regulieren kann, der Sigma-Faktor NccH jedoch nicht die Initiation der Transkription an den cnr-Promotoren.

Ralstonia metallidurans strain CH34 is resistant to nickel and cobalt cations. Resistance is mediated by the cnr determinant located on plasmid pMOL28, which encodes a proton-driven efflux pump. The cnr genes are organized in two operons, cnrYXH and cnrCBA. As revealed by primer extension, transcription from these operons is initiated from promotors located upstream of the cnrY and cnrC genes. Half-maximum activation from the cnrCBA operon was determined using appropriate lacZ operon fusions and was shown to occur at an Ni2+ concentration of 50 ÁM. The CnrH gene product, which is required for expression of both operons, is a sigma factor belonging to the sigmaE family with specifity for the promotors cnrYp and cnrCp in in vitro transcription assays. CnrH activity seems to be governed by the membrane-bound CnrY and CnrX gene products in response to Ni2+ . The periplasmic sensor protein CnrX binds 3 Ni2+ per polypeptide chain.
As shown with a yeast two hybrid system, the periplasmic nickel-binding protein CnrX interacts with the transmembrane protein CnrY. CnrX probably acts as a protease specific for CnrY, however, a glutamate residue in a HEXXH-motif in CnrX was not essential for CnrX activity. Finally, the CnrYX-related puative anti sigma factor complex NccYX from Achromobacter xylosoxydans 31A was shown to be able to regulate activity of CnrH, however sigma-factor NccH does not initiate transcription at cnr-promotors.

Keywords:
Ralstonia metallidurans, cnr, Achromobacter xylosoxydans, ECF-Sigma-Faktor, Anti-Sigma-Faktor, Schwermetallresistenz, Nickel-Bindung, Protein-Reinigung, Hefe-Zwei-Hybrid-System, Transkriptionelle Organisation, Metalloprotease

Ralstonia metallidurans, cnr, Achromobacter xylosoxydans, ECF sigma factor, anti-sigma factor, heavy metal resistance, nickel-binding, protein-purification, yeast two hybrid system, transcriptional organization, metalloprotease

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Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis, Abkürzungsverzeichnis (I-VII)
1. Einleitung (1-5)
2. Material und Methoden (6-58)
3. Ergebnisse (59-100)
4. Diskussion (101-127)
5. Zusammenfassung (128-130)
6. Literatur (131-146)