Martina Goldberg

Reinigung und aktive Rekonstitution von CzcA, einem Mitglied der RND-Proteinfamilie

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt an der Mathematisch-Naturwissenschaftlich-Technischen Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 28.02.2000

Abstract
Die czc-Determinante vermittelt dem Ralstonia spec.-Stamm CH34 Resistenz gegenüber Cobalt, Zink und Cadmium. Das CzcA-Protein ist der zentrale Kationen-Protonen-Antiporter des CzcCB2A-Efflux-Komplexes und gehört zur Familie der RND-Proteine. In dieser Arbeit wurde das CzcA-Protein gereinigt und anschließend Untersuchungen zur Transportaktivität von CzcA durchgeführt Das czcA-Gen wurde in den Vektor pASK-IBA3 kloniert und das CzcA-Protein erfolgreich in E.coli exprimiert. Das überexprimierte CzcA-Strep-tag- Fusionsprotein wurde mittels Affinitätschromatographie an Strep-Tactin Sepharose bis zur Homogenität gereinigt und anschließend aktiv in Detergenz destabilisierte Liposomen rekonstituiert.
Das CzcA-Protein besteht aus 12 transmembranen -Helices und zwei großen periplasmatischen Domänen. zwei konservierte Aspatat-Reste und ein Glutamat-Rest in einem dieser transmembranen Abschnitte sind für die Ausbildung der Schwermetallresistenz und den Kationen-Protonen-Antiport essentiell, jedoch nicht für die erleichterte Diffusion der Kationen.
Die Geschwindigkeit des CzcA vermittelten Zink und Cobalt-Transports konnte jeweils als sigmoidale Substratsättigunskurve dargestellt werden. Für den Zink-Transport wurde ein Vmax-Wert von 385 sec-1, eine Kooperativitätskonstante von n = 2 und ein Km-Wert von 6.6 mM ermittelt. Für den Cobalt-Transport wurde ein Vmax-Wert von 100 sec-1, eine Kooperativitätskonstante von n = 2 und ein Km-Wert von 18.5 mM ermittelt. Für den Cadmium-Transport ergab sich ein Vmax-Wert von 28 sec-1, eine Kooperativitätskonstante von n = 1 und ein Km-Wert von 7.7 mM. Die mutierten Proteine -CzcA-D402N und CzcA-D408N- wurden ebenfalls rekonstituiert. Hier wurde eine schnelle protonenunabhängige Akkumulation der Radioaktivität innerhalb der Proteoliposomen beobachtet. Jedoch waren die mutierten Proteine nicht mehr in der Lage den langsameren Protonen/Zink-Antiport durchzuführen.

Aus den resultierenden Ergebnissen läßt sich die Funktion des CzcA-Proteins am besten mit dem Modell einer Zweikanalpumpe beschreiben.

The membrane-bound CzcA protein, a member of the resistance-nodulation-cell division (RND) permease superfamily, is part of the CzcCB2A complex that mediates heavy metal resistance in Ralstonia sp. CH34 by an active cation efflux mechanism driven by cation/proton antiport. The czcA gene was cloned into the plasmid pASK-IBA3 and the CzcA-strep-tag- fusion protein was purified to homogeneity after expression in Escherichia coli, reconstituted into detergent destabilized liposomes., and the kinetics of heavy metal transport by CzcA was determined.
CzcA is composed of 12 transmembrane -helices and two large periplasmic domains. Two conserved aspartate and a glutamate residue in one of these transmembrane spans are essential for heavy metal resistance and proton/cation antiport but not for facilitated diffusion of cations.
The velocity of metal cation uptake was determined for all three metals. For zinc and cobalt, the substrate saturation curve was sigmoidal. For zinc a Vmax value of 385 s-1 was calculated from the velocites at 10 and 5 mM zinc, and this velocity was used for a Hill plot yielding a cooperativity constant n=2 and a K50 of 6.6 mM. For cobalt, using the velocity measured at 50 mM, a Hill plot was performed yielding a cooperativity constant n=2 and a K50 of 18.5 mM. Cadmium transport by CzcA was even slower than cobalt uptake. No uptake could be detected at concentrations lower than 1 mM or higher than 5 mM. In this narrow range of substrate concentration a Lineweaver-Burk plot was linear and yielded a Vmax of 28 s-1 and a Km of 7.7 mM.
The mutated proteins (CzcA-D402N and CzcA-D408N) also were reconstituted into detergent destabilized liposomes, and the kinetics of heavy metal transport by the mutated CzcA proteins were determined. When they were compared with the wild type protein, all three proteins displayed the rapid facilitated diffusion of zinc, but the mutant proteins were no longer able to catalyze the slower proton/zinc antiport.
Generalization of the resulting model for the function of CzcA as a two-channel pump might help to explain the function of RND proteins.

Keywords:
CzcA, RND-Proteine, Zink, Cobalt, Cadmium, Schwermetallresistenz, Protonen/Kationen-Antiport, Protonen-Relais-System, Zweikanalpumpe, Ralstonia sp. CH34

CzcA, RND proteins, zinc, cobalt, cadmium, heavy metal resistance, proton/cation antiport, proton-relais system, two channel pump, Ralstonia sp. CH34

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Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis, Abkürzungen (I-V)
1 Einleitung (1-3)
2 Material und Methoden (4-36)
3 Experimente und Ergebnisse (37-58)
4 Diskussion (59-75)
5 Zusammenfassung (76)
6 Literaturverzeichnis (78-88)