Matthias Bache

Molekularbiologische Untersuchungen an Weichteilsarkom-Zellinien mit unterschiedlichem p53-Genstatus nach Bestrahlung

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt an der Mathematisch-Naturwissenschaftlich-Technischen Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 23.11.2000

Abstract
Um die Bedeutung von p53 auf das strahlenbiologische Verhalten in Sarkomen zu bestimmen, wurden fünf humane Sarkom-Zellinien mit unterschiedlichem p53-Genstatus Zellinien (Wildtyp, Mutante, Null) auf eine Bestrahlung mit Röntgenstrahlen untersucht. Während in der Zellinie A-204 die Wildtypsequenz nachgewiesen werden konnte, wiesen die Zellinien US 8-93, LMS 6-93 und RD eine Mutation im p53 Gen auf bzw. wurde die Zellinie SAOS-2 als "p53-null Zellinie" eingesetzt. Das klonogene Zellüberleben nach einer Strahlendosis von 2 Gy (SF2) variierte von 28 bis 79 %. Verglichen mit den p53-mutierten Zellinien US 8-93, LSM 6-93 und RD (SF2 von 0.46 bis 0.79) zeigt die wt-p53 Zellinie A-204 (SF2=0.34) eine erhöhte Strahlensensitivität. Jedoch auch die p53-null Zellinie SAOS-2 ist sensitiv gegenüber einer Bestrahlung (SF2=0.28). Gemeinsam für alle untersuchten Sarkom-Zellinien war ein G2/M-Block und eine relativ geringe Apoptoserate (7.0 bis 18.0 %) nach Bestrahlung. Dabei existiert eine enge Kopplung zwischen dem Austritt der Zellen aus ihrer strahleninduzierten G2/M-Blockierung und der Induktion von Apoptose. Jedoch die Dauer des G2/M-Arrests korreliert nicht mit den Parametern der Strahlensensitivität (SF2, D10). Mittels Westernblotanalyse konnte weiterhin nachgewiesen werden, daß nur in der wt-p53 Zellinie A-204 eine Zunahme der P53-Expression nach Bestrahlung zu verzeichnen ist.
Um die Bedeutung des strahleninduzierten G2/M-Arrests zu verstehen, wurde die Möglichkeit getestet, in zwei WTS-Zellinien mit mt-p53 (US 8-93 und LMS 6-93) mittels Taxol- oder Koffeinbehandlung Veränderungen in der Strahlensensitivität zu induzieren. Eine Inkubation mit Taxol (20 to 100 nM) führt in beiden Zellinien zu einem G2/M-Arrest. Nach der Inkubation war eine dramatische Abnahme des klonogenen Zellüberlebens zu beobachten, was zeigt, daß beide Zellinien sensitiv gegenüber einer Taxolbehandlung sind. Die Inkubation mit Koffein resultiert in der Abnahme von G2/M- und S-Phase Zellen bzw. in einer Anreicherung an G1-Zellen. Eine zunehmende Koffeinkonzentration 0,5-5 mM führt in beiden Zellinien zu einer deutlichen Wachstumsinhibierung mit einem IC50 von ca. 2 mM. Weiterhin konnte gezeigt werden, daß in beiden WTS-Zellinien durch eine Koffeinbehandlung der strahleninduzierte G2/M-Arrest verhindert wird. Dieser Befund korreliert mit einer Strahlensensitivierung, obgleich das Fehlen des strahleninduzierten G2/M-Arrests nicht an eine direkte Induktion der Apoptose gekoppelt ist. Der Effekt der Strahlensensitivierung wird mit zunehmender Strahlendosis stärker. Im Vergleich mit der Zellinie LMS 6-93 führt eine Koffeinbehandlung insbesondere in der Zellinie US 8-93 zu einer deutlichen Strahlensensitivierung. Dieser Effekt scheint durch Unterschiede in der G2/M-Regulation bzw. in der DNS-Reparatur hervorgerufen zu werden. Mittels Westernblotanalyse konnte nachgewiesen werden, daß Koffein eine Sensitivierung gegenüber einer Bestrahlung unabhängig von einer wt-p53 Aktivierung hervorruft.
Mit diesen Ergebnissen wird der aus der Literatur bekannte Befund bestätigt, daß Tumorzellen nicht generell strahlenresistent sind, wenn sie einen p53-Gendefekt aufweisen. Insgesamt scheint p53 sowohl den G2/M-Arrest, die G2/M-Transition und die Induktion der Apoptose aktiv zu beeinflussen. Unsere Ergebnisse zeigen weiterhin, daß die Modulation des strahleninduzierten G2/M-Arrests insbesondere in Zellinien mit einem defekten p53-Gen zu einer Strahlensensitivierung führt. So läßt sich insgesamt schlußfolgern, daß der p53-Genstatus, die Induktion der Apoptose und die G2/M-Arretierung in den untersuchten Sarkom-Zellinien wesentliche Faktoren der Strahlensensitivität sind.

To determine the role of p53 in radiation response of sarcomas, it was investigated five human sarcoma cell lines with different p53 gene status status (wild type, mutation, null) in their response to X-rays. The p53 status of the cell lines was mutant (US 8-93, LMS 6-93 and RD), null (SAOS-2) and wildtype (A-204). Clonogenic survival of the cell lines varied as the survival fraction was at 2 Gy (SF2) ranging from 0.28 to 0.79. Compared with the mutated p53 cell lines (SF2 with a range from 0.46 to 0.79) the clonogenic survival of the wildtype p53 (wt-p53) cell line A-204 (SF2=0.34) was lower. The p53 null cell line (SAOS-2) was also sensitive to X-rays (SF2=0.28). We detected, in all cell lines a similar behavior in their response to irradiation with G2/M arrest and apoptosis. But the maximal rate of apoptosis with a range from 7.0 to 18.0 % was rather small. The decrease of G2/M cells was coupled with an increased percentage of apoptotic cells. However, a different delay in G2/M did not result in a change of radiation sensitivity (SF2, D10). Western analyses showed an increased p53 level only for the cell line A-204 (wt-p53) after irradiation.
Furthermore, to determine the role of irradiation induced G2/M arrest in two human sarcoma cell lines both with a p53 mutation (US 8-93 and LMS 6-93) it was examined the modulation of radiosensitivity by using caffeine or taxol. Incubation with taxol (20 to 100 nM) resulted in a G2/M arrest for both cell lines. After the incubation it was found a dramatical reduced clonogenic survival. It showes that both cell lines are sensitiv for taxol. Incubation with caffeine resulted in a low percentage of S and G2/M cells, associated with an accumulation in G1. With a higher caffeine concentration, we detected a lower clonogenic survival with IC50 at 2 mM. Furthermore, in both cell lines incubation with caffeine completely prevents the irradiation induced G2/M arrest. This was connected to radiosensitization, but without direct correlation to an induction of apoptosis. The effect of radiosensitization rose with higher irradiation doses. However, in comparison with LMS 6-93, it was stronger in cell line US8-93. It seem to be that this effect is correlated with difference G2/M response and initial DNA-damage repair. Results of Western hybridization reveal a p53-independent mechanism of radiosensitization caused by caffeine.
Our results point out that there is not always a simple relationship between p53 gene status and radiation sensitivity. We suggest, that wt-p53 plays an active role in G2/M arrest and in decreasing the number of G2/M cells as a response to apoptosis. Our findings suggest, that modulation in irradiation induced G2/M may affect a common checkpoint for tumor cells with defective p53 function. To sum up, we suggest that the p53 gene status, the irradiation induced apoptosis and G2/M arrest are important determinants of radiosensitivity in the analyzed human sarcoma cell lines.

Keywords:
Weichteilsarkom-Zellinien, p53-Genstatus, Strahlensensitivität, Apoptose, G2/M-Arretierung, Koffein, Taxol

soft tissue sarcoma cell lines, p53 gene status, radiosensitivity, apoptosis, G2/M arrest , caffeine, taxol

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Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis, Abkürzungen, Einheiten und Begriffserläuterungen
1 Einleitung (1-16)
2 Material (17-23)
3 Methoden (24-36)
4 Ergebnisse (37-63)
5 Diskussion (64-90)
6 Zusammenfassung (91-94)
7 Literatur (95-113)