Tatyana Areshchenkova

Isolation, characterization and mapping of microsatellites from the tomato genome and their application in molecular analysis of centromeric regions

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt an der Mathematisch-Naturwissenschaftlich-Technischen Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 11.07.2000

Abstract
Die Verfügbarkeit von hochgradig polymorphen molekularen Markern ist für die genetische Kartierung und Genomanalyse von Organismen mit geringer Variabilität von großer Bedeutung. Mikrosatelliten werden zunehmend zum Markersystem der Wahl, weil sie einen hohen Grad von Polymorphismus zeigen und ihre Anwendung automatisierbar ist.
Ziel der vorliegenden Forschungsarbeit war die Isolierung, Charakterisierung und Kartierung von Mikrosatelliten für Tomate. Durch die Sichtung von zwei Typen von genomischen Bibliotheken und der Tomaten-EST-Datenbank konnte eine beträchtliche Anzahl von Markern aus verschiedenen Regionen des Genoms isoliert werden. Die Sequenzanalyse zeigte, daß diese Mikrosatelliten überwiegen komplex aufgebaut, also aus verschiedenen repetitiven Motiven bestehen. Darüber hinaus zeichnen sich die Mikrosatelliten aus der Tomate durch eine hohe Zahl von Wiederholungen aus, was im Vergleich zu anderen Arten ungewöhnlich ist. Diese besonderen Merkmale der Tomatenmikrosatelliten haben einen negativen Einfluß auf die Effizienz der Markerisolation.
Trotz ihres komplexen Aufbaus zeigen die Mikrosatelliten eine große Variabilität zwischen verschiedenen Sorten von Lycopersicon esculentum. Die isolierten Marker zeigten bis zu fünf Allele in zwölf Linien von L. esculentum, und die meisten waren zwischen L. esculentum und L. pennellii polymorph. Die anhand von 14 Markern geschätzte genetische Distanz von Tomatensorten liegen zwischen 0.21 und 0.74 mit einem durchschnittlichen Wert von 0.42. Wegen der großen Zahl von Allelen im L. esculentum-Genpool eignen sich die Marker für die Genotypisierung von Tomatensorten und -akzessionen.
Insgesamt wurden 41 Marker, die 43 unabhängige Loci detektieren, in die dicht besetzte Kopplungskarte von Tomate eingefügt. Alle 31 aus genomischen Bibliotheken stammenden Marker kartierten ausschließlich in der Nähe der Zentromere verschiedener Chromosomen. Eine solche Häufung von genomischen Mikrosatelliten in Zentromerbereichen wurde bisher in keiner anderen Pflanzenart beschrieben. Im Gegensatz dazu waren nur zwei der auf ESTs basierenden Markern mit einem Zentromer gekoppelt. Die anderen acht waren zufällig im Euchromatin verteilt.
Die Tatsache, daß die in dieser Arbeit isolierten Tomatenmikrosatelliten vornehmlich nahe dem Zentromer liegen, macht sie für die genetische Kartierung weniger wertvoll, bietet aber eine Möglichkeit zur molekularen Charakterisierung zentromerischer Regionen einzelner Tomatenchromosomen. Durch die Isolierung von YAC-Klonen, die homolog zu den zentromerassoziierten Mikrosatelliten sind, konnte eine Reihe neuer repetitiver DNA-Sequenzen aus dem Tomatengenom charakterisiert werden.

Availability of highly polymorphic molecular markers is of great importance in genetic mapping and genome analysis in organisms with low levels of variation. Microsatellites are becoming the marker assay of choice, because they reveal high levels of polymorphism and are amenable to automation.
This research work was aimed at isolation, characterization and mapping of microsatellites in tomato. A considerable number of markers was isolated from different genomic regions by screening two types of genomic libraries and the tomato EST database. Sequence analysis revealed that the majority of microsatellites were complex, representing combinations of different types of repeated motifs. Moreover, tomato microsatellites were characterized by a high number of repeats that was unusual compared to other plant species. Such features of tomato microsatellites influenced negatively the efficiency of marker isolation.
Despite the complex structure, microsatellites display high variability in Lycopersicon esculentum varieties. Newly isolated markers detected up to five alleles in a set of twelve L. esculentum lines and the majority were polymorphic between L. esculentum and L. pennellii. Genetic distances between tomato cultivars estimated by using fourteen markers ranged from 0.21 to 0.74 with an average of 0.42. Due to the large number of alleles in L. esculentum gene pool, the markers can be used in genotyping tomato cultivars and accessions.
A total of 41 markers detecting 43 independent loci were mapped onto the tomato high-density molecular linkage map. All 31 markers isolated from genomic libraries mapped exclusively near the centromeres of different chromosomes. Such clustering of genomic microsatellite repeats has not been described for other plant species. In contrast, only two markers of ten generated from EST sequences were centromere-linked. The other eight were randomly distributed in euchromatin.
The fact of predominant centromeric clustering of tomato microsatellites isolated in this study decreases their value in genetic mapping experiments but these markers provide a unique opportunity for the molecular characterization of centromeric regions on individual tomato chromosomes. By the isolation of YAC clones homologous to the centromere-associated microsatellites, it was possible to characterize a number of new repeated DNA sequences from the tomato genome.

Keywords:
Mikrosatelliten, molekulare Marker, genetische Variabilität, genetische Kartierung, Lycopersicon esculentum, Zentromer

Microsatellites, molecular markers, genetic variability, genetic mapping, Lycopersicon esculentum, centromere

Online-Dokument im PDF-Format (3.465 KB) mit integrierter Gliederung.

Inhaltsverzeichnis
Contents, List of abbreviations
1. Introduction (1-13)
2. Materials and methods (14-31)
3. Results (32-60)
4. Discussion (61-74)
5. Abstract, Zusammenfassung (75-77)
6. References (78-88)
Appendix (i-iv)