Ulla Grauschopf

Strukturelle und funktionelle Untersuchungen am humanen Parathormon-Rezeptor

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt an der Mathematisch-Naturwissenschaftlich-Technischen Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 13.09.2000

Abstract
Der humane Parathormon-Rezeptor gehört zur Familie B der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren. Mitglieder dieser Rezeptorenfamilie binden Peptidhormonliganden, wie das Parathormon, Glucagon, Secretin oder Vasopressin. Die Struktur der Rezeptoren beeinhaltet neben den sieben Transmembran-Helizes und der intrazellulären Effektordomäne ein großes (100 bis 200 Aminosäurereste) N-terminales Rezeptorsegment. Diesem Segment, das sechs konservierte Cysteinreste und mehrere Glykosylierungsstellen aufweist, wird eine entscheidende Rolle an der Ligandenbindung zugewiesen. In der vorliegenden Arbeit sollte der humane Parathormon-Rezeptor, der bisher nur auf zellulärer Ebene untersucht worden war, isoliert und auf Proteinebene strukturell und funktionell charakterisiert werden.
Studien wurden dabei auf drei Teilebenen betrieben: (1) hPTHR wurde in einem Säugerzell-Expressionssystem exprimiert und konnte aus den Zellmembranen isoliert werden, um erste Charakterisierungsschritte durchzuführen. Aufgrund der geringen Expression wurde jedoch zur Herstellung des Proteins in einem prokaryontischen Expressionssystem übergegangen. (2) Mit einer Expression des N-terminalen Rezeptorteils sollte die Hypothese einer N-terminalen Ligandenbindungsdomäne überprüft werden. Die Rückfaltung dieses Rezeptorfragments aus E. coli inclusion bodies lieferte eine stabile Proteindomäne mit der Fähigkeit zur Ligandenbindung. Untersuchungen zu strukturellen Eigenschaften dieser Domäne (Aufklärung des Disulfidmusters u.a.) sowie der molekularen Wechselwirkung mit Parathormon wurden durchgeführt. (3) Die Untersuchung des Gesamtrezeptors wurde nach prokaryontischer Expression in inclusion bodies und Rückfaltung fortgeführt. Es werden erste Ansätze zur Entwicklung geeigneter Herstellungsmethoden des gesamten Rezeptorproteins in für strukturelle Untersuchungen ausreichenden Mengen vorgestellt.

Human parathyroid-hormone receptor belongs to class B of G-protein coupled receptors. Members of this receptor class bind peptide ligands such as parathyroid-hormone, glucagon, secretin or vasopressin. The structure of the receptor molecules includes beside the seven transmembrane helices and the intracelullar effector domain a large (100 to 200 amino acid residues) N-terminal receptor segment. This segment, which posseses six conserved cysteine residues and some glycosylation sites, is involved in ligand-binding. This thesis addresses the functional and structural characterization of the parathyroid-hormone receptor. Studies on the parathyroid hormone receptor were conducted in three parts: (1) PTHR was expressed in an eukaryotic mammalian cell-line and isolated from cell-membranes for basic characterization. Since the very low expression levels in this system, a procaryotic expression system was chosen for further studies. (2) The N-terminal segment, nPTHR, was expressed in E. coli as inclusion body protein to test the hypothesis of an extrazellular ligand-binding domain. Refolding from E. coli inclusion bodies resulted in a stable protein domain with ligand binding capacity. Structural and functional properties of nPTHR were further characterized (e.g. analysis of disulfide pattern). (3) Investigations on the whole receptor molecule were performed after procaryotic expression in inclusion bodies and renaturation. First approaches to develop appropriate methods to provide large enough amounts of protein for structural studies are provided.

Keywords:
G-protein gekoppelter Rezeptor, Renaturierung, Ligandenbindung, Membranprotein, Disulfidmuster

G-protein coupled receptor, renaturation, ligand binding, membrane protein, disulfide pattern

Online-Dokument im PDF-Format (2.513 KB) mit integrierter Gliederung.

Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis (I-III)
I Einleitung (1-15)
II Material und Methoden (16-42)
III Experimente und Ergebnisse (43-86)
IV Diskussion (87-100)
V Literaturverzeichnis (101-112)
VI Abkürzungen (113)