Dirk Esser

Etablierung proteinbasierter Transfersysteme

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt an der Mathematisch-Naturwissenschaftlich-Technischen Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 14.12.2000

Abstract
Methoden zum Transfer von Substanzen in eukaryontische Zellen, insbesondere zum Gentransfer, haben enorme Bedeutung für die Biotechnologie und Medizin. Allerdings gibt es weiterhin einen erheblichen Entwicklungsbedarf bezüglich nicht toxischer, effizienter, und kostengünstig herzustellender Vektoren; in rekombinanten Escherichia coli produzierte Vektoren auf Proteinbasis sind dabei sehr attraktiv. Die vorliegende Dissertation stellt primär eine vergleichende Studie über zwei dieser Vektoren auf Proteinbasis dar. Einer der beiden Vektoren verwendet das Haupthüllprotein des Polyomavirus PyVP1, das andere System basiert auf dem hyperthermophilen Protein HU aus Thermotoga maritima (TmHU).
Erstmalig konnte mittels virusanaloger Partikel aus in E. coli hergestelltem PyVP1 die Transfektion von Plasmid-DNA in eukaryotischen Zellen nachgewiesen werden. Die Effizienz war dabei jedoch nur gering. Die Verwendung N-terminaler Varianten von PyVP1 erbrachte keine Verbesserung der Transfektionseffizienz. Eine Verpackung von Substanzen in Proteinhüllen, die zuvor an eine Matrix immobilisiert wurden, wurde im Rahmen der Arbeit erstmalig vorgestellt.
Nach Klonierung und Reinigung wurde das hyperthermophile Protein TmHU physikochemisch und biophysikalisch detailliert analysiert (z.B. DNA-Bindung, thermische Stabilität von TmHU und TmHU/DNA-Komplexen). Anschließend wurde ein effizientes Protokoll zur Transfektion von eukaryotischen Zellen mittels TmHU entwickelt. Die Transfektion gelang dabei bei mehreren Zelllinien. Eine weitere Einsatzmöglichkeit von TmHU ist die des enhancers für Lipofektion. Es konnte ebenfalls gezeigt werden, daß TmHU auch als Transportsystem für Peptide und Proteine in Zellen geeignet ist. Nicht nur in vitro, sondern auch in vivo wurde das nichttoxische TmHU getestet. In ersten Tierversuchen (Mausmodell) konnte gezeigt werden, daß TmHU die Transfektionseffizienz erheblich steigert.

Methods for the transfer of molecular substances into eukaryotic cells, mainly for gene transfer, have an enormous impact on biotechnology and medicine. However, there is still a significant demand for non-toxic, efficient, and cheap vector systems; vehicles produced in recombinant Escherichia coli are very attractive in this respect. The Ph.D. thesis presented here is a comparative study on two vector systems based on proteins. One of these vectors uses the main coat protein VP1 from Polyomavirus (PyVP1), the other system is based on the hyperthermophilic protein HU from Thermotoga maritima (TmHU).
For the first time recombinantly produced VP1 was shown to transport plasmid DNA into eukaryotic cells. However, the efficiency was low in these experiments. Using N-terminally modified variants of PyVP1 did not improve the transfection yields. The directed packaging of substances in protein shells using matrix immobilization was demonstrated in this work for the first time.
The hyperthermophilic protein TmHU was cloned, purified, and analyzed in detail using physicochemical and biochemical methods (e.g. with respect to DNA binding, thermal stability of the protein and TmHU/DNA complexes, respectively). Next, an efficient protocol was developed for the transfection of eukaryotic cells using TmHU. Transfection was successful using several different cell lines. Also, TmHU can be used as an enhancer for lipofection. It was demonstrated that TmHU is useful as a protein transduction domain for proteins and peptides. The protein was tested in vitro (cell culture) as well as in vivo; using mouse models, it was shown that the non-toxic TmHU can improve transfection yields significantly.

Keywords:
Polyomavirus VP1, Thermotoga maritima, HU-Protein, Gentherapie, Drug Delivery, Proteintechnologie, Vektorsystem

Polyomavirus VP1, Thermotoga maritima, HU protein, gene therapy, drug delivery, protein technology, vector system

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Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis (I-IV)
1 Einleitung (1-27)
2 Material und Methoden (28-59)
3 Experimente und Ergebnisse: Polyoma-VP1 (60-84)
4 Experimente und Ergebnisse: TmHU (85-132)
5 Diskussion der VP1-Untersuchungen (133-142)
6 Diskussion der TmHU-Untersuchungen (143-155)
7 Zusammenfassung (156-161)
8 Literaturverzeichnis (162-182)
9 Anhang (183-187)