Andrea Gräntzdörffer

Formiat-Stoffwechsel in Eubacterium acidaminophilum: Molekulare und biochemische Charakterisierung der Wolfram- und Selen-haltigen Formiat-Dehydrogenasen sowie einer Eisen-Hydrogenase

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt an der Mathematisch-Naturwissenschaftlich-Technischen Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 14.12.2000

Abstract
Der Gram-positive Anaerobier Eubacterium acidaminophilum vergärt Aminosäuren in Stickland-Reaktionen, wobei Formiat als Elektronendonor verwendet wird. Zwei zueinander homologe Formiat-Dehydrogenase-Gensätze wurden identifiziert und deren Transkription mittels Northern Hybridisierungen, Primer Extension und RT-PCR untersucht. Beide Gensätze enthalten je ein Gen für die katalytische Untereinheit FdhA und die vermutlich Elektronen-transferierende Untereinheit FdhB.
Die Formiat-Dehydrogenase II wurde homogen dargestellt und liegt in vivo assoziiert mit einer Eisen-Hydrogenase vor, deren kodierende Gene ebenfalls identifiziert wurden. Anhand von Sequenzhomologien können für den Komplex aus Formiat-Dehydrogenase und Hydrogenase insgesamt 19 Eisen-Schwefel-Zentren postuliert werden. In der hochaktiven, Sauerstoff-empfindlichen Formiat-Dehydrogenase konnte Wolfram, Selen und Eisen nachgewiesen werden. Das Wolfram wird durch Molybdopterin komplexiert, das Selen in Form von Selenocystein co-translational in die Polypeptidkette inkorporiert. Das Enzym ist in der Lage, neben der Formiat-Oxidation auch die thermodynamisch ungünstige Rückreaktion, die CO2-Reduktion, zu katalysieren.
Zur weiteren Charakterisierung des Proteins, das in E. coli nicht als Selenoprotein exprimierbar ist, wurde begonnen, ein Transformationssystem für E. acidaminophilum zu etablieren. In diesem Zusammenhang wurde ein Restriktionsmodifikationssystem charakterisiert, sowie die surface layer untersucht.

The Gram-positive anaerobe Eubacterium acidaminophilum ferments amino acids in Stickland reactions using formate as electron donor. Two homologous formate dehydrogenase gene clusters were identified containing one gene each coding for the catalytic subunit FdhA and the presumed electron transferring subunit FdhB. Their transcription was investigated by means of northern hybridizations, primer extension, and RT-PCR.

The formate dehydrogenase II was purified to homogeneity. It was shown to be associated with an iron-only hydrogenase whose coding region was identified, too. According to sequence similarities 19 iron-sulfur clustern may be postulated for this complex. The oxygen sensitive, highly active formate dehydrogenase is containing tungsten, selenium, and iron. Tungsten is complexed by molybdopterin, selenium is incorporated as selenocysteine cotranslational into the polypeptide chain. In addition to the formate oxidation, the enzyme was demonstrated to catalyze the thermodynamically unfavourable reduction of CO2.
For further characterization of this enzyme that cannot be expressed as selenoprotein in E. coli, the establishment of a transformation system for E. acidaminophilum was started. A restriction modification system as well as the surface layer were characterized.

Keywords:
Formiat-Dehydrogenase, Eubacterium acidaminophilum, Wolfram, Selenocystein, Molybdopterin, Eisen-Schwefel-Zentrum, Eisen-Hydrogenase, Restriktionsmodifikationssystem, S-Layer

Formate dehydrogenase, Eubacterium acidaminophilum, tungsten, selenocysteine, molybdopterin, iron sulfur cluster, iron-only hydrogenase, restriction modification system, surface layer

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Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis, Abkürzungsverzeichnis
1 Einleitung (1-6)
2 Material und Methoden (7-39)
3 Experimente und Ergebnisse (40-96)
4 Diskussion (97-134)
5 Zusammenfassung (135-137)
6 Literaturverzeichnis (138-152)
Anhang (153-168)