Temuujn Dansranjavin

Untersuchung der Apoptose und der regulierenden Faktoren Fas/Fas-Ligand, p53 und cl-2 in der normalen menschlichen Spermatogenese und in der Genese von Keimzelltumoren

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt an der Mathematisch-Naturwissenschaftlich-Technischen Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 07.12.2000

Abstract
Die Erkenntnisse über die Apoptose im männlichen Keimepithel in Tiermodellen zeigen deutlich die bedeutende Rolle der Apoptose in der Spermatogenese sowie in der Genese krankhafter Veränderungen der Keimzellen. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war, das Verteilungsmuster apoptotischer Keimzellen sowie die Expression der apoptoseassoziierten Proteine Fas/Fas-Ligand, p53 und bcl-2 in der Spermatogenese und in der Genese der Hodentumore beim Menschen näher zu untersuchen, um die Rolle der Apoptose in diesen Prozessen aufzuzeigen. In der vorliegenden Studie wurden in etwa 8,8% der untersuchten Keimtubuli apoptotische Keimzellen nachgewiesen. Die Keimzellen im menschlichen Hoden wiesen hinsichtlich des Apoptosevorkommens eine Abhängigkeit vom Entwicklungsstadium auf. Den größten Anteil der apoptotischen Zellen machten die Spermatozyten mit ca. 63% und die Spermatiden mit ca. 30% aus. Dagegen waren nur ca. 7% der apoptotischen Keimzellen Spermatogonien.
Von den untersuchten Apoptoseregulatoren konnte der Fas-Ligand in Sertolizellen nachgewiesen werden. Diese Tatsache unterstützt die Untersuchungsergebnisse an Maushoden, in welchen der Fas-Ligand in den Sertolizellen exprimiert wird und ein wichtiges Bindeglied in der parakrinen Kontrolle der Keimzellapoptose darstellt. Die Häufigkeit und das Expressionsmuster vom p53-Protein waren nicht mit der Apoptose assoziiert. Das bcl-2-Protein konnte im menschlichen Hoden nur in lymphozytären Infiltraten von Keimzellen nachgewiesen werden. Die Tatsache, daß p53 ausschließlich in den Spermatogonien nachgewiesen wurde, deutet auf seine Rolle während der Mitose hin.
Die Untersuchung der Hodentumore ergab, daß die Apoptosehäufigkeit bei präinvasiven CIS-Zellen höher als bei normalen Keimzellen ist. Die hohe Apoptoserate könnte einen indirekten Hinweis auf eine Anhäufung von Zellen mit irreparablen DNA-Schäden darstellen. Die Apoptoserate in invasiven Seminomen war im Vergleich zu präinvasiven CIS signifikant niedriger. Die präinvasiven CIS-Zellen und Tumorzellen in soliden Seminomen wiesen im Vergleich zu den Spermatogonien in normalen Hodengewebe eine Überexpression des p53-Proteins auf. Die Abnahme der Apoptoserate in soliden Seminomen im Vergleich zu den CIS-Zellen war mit einer Senkung der p53-Expression assoziiert. Im Unterschied zu normalen Keimzellen war die p53-Expression in neoplastischen Zellen mit der Apoptosehäufigkeit assoziiert. Es war keine Assoziation zwischen der bcl-2-Expression und Apoptose in Keimzelltumoren nachweisbar. Dies deutet darauf hin, daß eine Verschiebung des homöostatischen Gleichgewichts auf Kosten der Apoptose einen wichtigen Aspekt im Wachstums solider Seminome darstellt.

The seminiferous epithelium is a rapidly proliferating tissue in which programmed cell death (apoptosis) plays a crucial role in maintaining tissue homeostasis and genomic integrity. Several potential physiological regulators of apoptosis such as Fas/Fas ligand, p53 and bcl-2 have been recently reported to be expressed in human and murine testicular tissue. However, the precise cell types in human testicular tissue in which these antigens have been detected and its implication in apoptotic process remain partly not uniform or even controversial. In the present study we evaluated the spatial pattern of apoptosis and its related antigens in normal human testicular tissue specimens revealing normal spermatogenesis and in testicular germ cell tumors using in situ end-labeling, RT-PCR, immunoblot and immunohistochemical methods. The incidence of apoptosis was a rare event and was seen only in single cells in approximately 8,8% of a total of 7621 seminiferous tubules. Apoptotic cells were detected mainly by spermatocytes (63%) and spermatids (30%) and rarely by spermatogonia (7%). In all tissue specimens as ligand (37 kD), p53 (53kD) and bcl-2 (26kD) immunoreactive bands were detectable. Immunohistochemical analysis shows that as ligand antigen was present on Sertoli cell surface. The expression of p53 was restricted only to single spermatogonia. The bcl-2 antigen was not detectable in seminiferous epithelium but a strong staining revealed adjacent lymphocytes. This data suggest that germ cell apoptosis in human testis is controlled by as/ as ligand pathway and not by p53 or bcl-2 proteins. p53 appears to be implicated in DNA repair and differentiation of spermatogonia rather than in the initiation of apoptosis in human germ cell population.
Twelve seminomas and nine tissue specimens containing precancerous carcinoma in situ (CIS) were examined for the apoptosis and expression of its related antigens ( as/ as ligand, p53, bcl-2). CIS cells demonstrated high rates of apoptosis compared to tumor cells in solid seminomas. A decrease of apoptosis was closely associated with down regulation of the p53-expression. No association was found between bcl-2 expression and apoptosis in germ cell tumors. The bcl-2 expression was revealed only in adjacent lymphocytes but undetectable in seminomas and in CIS. Our results indicate that decreased apoptotic cell death in germ cell tumors might be regulated by p53 protein.

Keywords:
Spermatogenese, Seminom, Apoptose, Fas/Fas-Ligand, p53, bcl-2, Westernblot, Immunhistochemie

spermatogenesis, seminoma, apoptosis, Fas/Fas-Ligand, p53, bcl-2, westernblot, immunohisto-chemistry

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Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis, Abkürzungsverzeichnis
1. Einleitung (1-19)
2. Material und Methoden (20-27)
3. Ergebnisse (28-44)
4. Diskussion (45-58)
5. Zusammenfassung (59-60)
6. Literaturverzeichnis (61-74)