Arndt Dietrich

Native und rekombinante Pyruvatdecarboxylase aus Pisum sativum - Gemeinsamkeiten und Unterschiede in Struktur und Funktion

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt an der Mathematisch-Naturwissenschaftlich-Technischen Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 31.01.2001

Abstract
Ein Pyruvatdecarboxylase-Gen von Pisum sativum (PDC1) wurde in der Hefe Saccharomyces cerevisiae exprimiert. Die resultierende homomere rekombinante Pyruvatdecarboxylase (rekombinante PsPDC) mit einer Untereinheitenmasse von 64 kDa war löslich und hatte ähnlich nativer PsPDC eine spezifische Aktivität von 57 U/mg. Wie sich in elektronenmikroskopischen Aufnahmen zeigte, bilden sowohl das native als auch das rekombinante Holoenzym filamentöse Formen aus. Die Abtrennung der Cofaktoren ThDP und Mg2+ führte zur reversiblen Dissoziation in die kleineren Apoenzymoligomere. Die Bildauswertung von transmissionselektronenmikroskopischen Aufnahmen zeigte, dass beide Holoenzymfilamente aus einer Kette von zueinander verdrehten Strukturbausteinen mit einer axialen Periode von 19,29 nm (rekombinante PsPDC) bzw. 19,05 nm (native PsPDC) aufgebaut sind. Diese Periodenlängen entsprechen drei sich wiederholenden Einheiten pro Windung, welche in Rastertransmissionselektronenmikroskopieuntersuchungen als Tetramere identifiziert wurden. Die Nah-UV CD-Spektren und die Fluoreszenzspektren der Apo- und Holoenzyme von beiden PsPDC-Spezies unterschieden sich in den gleichen Aspekten, was auf eine sehr ähnliche Tertiärstruktur der Enzyme hindeutet. Der S0.5 -Wert für Pyruvat war mit 2 mM bei 30C für rekombinante PsPDC doppelt so hoch wie für das native Enzym. Wie native PsPDC wird auch das rekombinante Enzym durch Pyruvat aktiviert. Allerdings ist das resultierende sigmoide Verhalten in der v/S-Charakteristik wesentlich stärker ausgeprägt. Für den Umsatz eines Substratmoleküls bei der Maximalgeschwindigkeit müssen zumindest 3 Substratmoleküle gebunden werden. Wie in stopped-flow Messungen gezeigt werden konnte, spiegelt sich diese Eigenschaft auch in den kinetischen Parmetern des zeitlichen Ablaufs der Substrataktivierung wider.

A pyruvate decarboxylase gene of Pisum sativum (PDC1) was expressed in the yeast Saccharomyces cerevisiae. The recombinant homomeric pyruvate decarboxylase (recombinant PsPDC) of subunit molecular mass 64 kDa, was soluble and had a specific enzymatic activity of 57 U/mg, which is comparable to that of native PsPDC. As revealed by electron microscopy, the native and the recombinant holoenzymes form filamentous structures. Removal of the cofactors ThDP and Mg2+ caused reversible dissociation to the lower apoenzyme oligomers. Image analysis, made from transmission electron microscopy images of negatively stained samples, showed both holoenzyme filaments to be a twisted string of building blocks with axial periods of 19.29 nm and 19.05 nm for the recombinant and native PsPDC, respectively. These values correspond to three repeating units per turn, which mass measurement by scanning transmission electron microscopy identified as tetramers. Near UV CD spectra and fluorescence spectra of the apo- and holoenzyme species differed in the same way for the native and the recombinant PsPDC proteins indicating very similar tertiary structures of both enzyme forms. The S0.5 value of pyruvate was 2 mM at 30C for the recombinant enzyme which is twice as high as for the native protein. Like the native enzyme, recombinant PsPDC is activated by its substrate pyruvate. However, the sigmoidal behaviour in the v-S characteristics is much more pronounced, indicating that at least three substrate molecules must be bound for the decarboxylation of one molecule at maximum velocity. As revealed by stopped-flow measurements, this behaviour is reflected by the kinetic parameters of the substrate activation process.

Keywords:
Pyruvatdecarboxylase, Tertiär- und Quartärstruktur, Proteinfilamente, Substrataktivierung

pyruvate decarboxylase, tertiary and quaternary structure, protein filaments, substrate activation

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Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis, Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung (1-6)
2. Material und Methoden (7-20)
3. Ergebnisse und Diskussion (21-68)
4. Zusammenfassung (69-71)
5. Literaturverzeichnis (72-79)