Maja Adamska

Nkx5 genes in inner ear development and genome evolution

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt an der Mathematisch-Naturwissenschaftlich-Technischen Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 22.1.2001

Abstract
Nkx5-1 ist ein Transkriptionsfaktor, der bereits früh in der Innenohrentwicklung exprimiert wird und essentiell für die Ausbildung der Bogengänge ist. In der vorliegenden Arbeit wurden die Evolution der Nkx5-Genfamilie und funktionelle Eigenschaften des Nkx5-1-Proteins untersucht. Fünf zuvor identifizierte Nkx5-Gene des Medakafischs wurden charakterisiert, indem ihre vollständigen genomischen und kodierenden Sequenzen bestimmt und ihre Expressionsmuster analysiert wurden. Die phylogenetische Analyse der Nkx5-Gene zeigte, daß im Vertebratengenom vier paraloge Gruppen von Nkx5-Genen existieren, in Invertebratenarten hingegen nur eine Gruppe. Im Medakagenom sind Mitglieder aller vier Gruppen vertreten (im Gegensatz zu anderen Vertebraten, bei denen einige Nkx5 Gene entweder verloren gingen oder noch nicht entdeckt wurden) und Nkx5-1 wird von zwei paralogen Genen repräsentiert. Diese Situation steht mit neueren Hypothesen, die Genomduplikationenn im Zuge der Vertebratenentwicklung postulieren, im Einklang. Die in dieser Arbeit erhaltenen Daten haben mich veranlaßt, ein Modell zur Evolution dieser konservierten Gengruppe vorzuschlagen.
In der Zebrafischmutante acerebellar (ace) sind Ohrplakoden und -vesikel stark verkleinert und die ohrspezifische Expression verschiedener Transkriptionsfaktoren im Vergleich zur Wildtypsituation deutlich reduziert. Ich habe die Zebrafisch Nkx5-1 cDNA isoliert und ihre Expression in Wildtyp- und ace-Embryonen untersucht. Dabei zeigte sich, daß die Aktivität von zfNkx5-1 in ace-Ohrplakoden und -vesikeln deutlich verringert ist. Im Hühnchen-Modellsystem habe ich im Anschluß die Auswirkungen einer ektopischen FGF-Quelle auf die Expression von Nkx5-1 und andere ohrspezifische Transkritionsfaktoren untersucht. Diese Experimente zeigten, daß eine zusätzliche FGF-Quelle die Expression von Nkx5-1, SOHo und Pax2 aktivieren kann, während die des Dlx5-Gens leicht abgeschwächt wird. Darüber hinaus waren ektopische FGF2-Quellen in der Lage, ektopische Ohrstrukturen zu induzieren. In Hühnchenembryonen wird FGF8 transient im anterioren Teil der Plakode exprimiert. Dieses Muster weist auf eine mögliche Regulation der Nkx5-1-Gens durch FGF8 hin.
Das Expressionsmuster von Dlx5 im Innenohr von Maus und Huhn ist dem des Nkx5-1 Gens sehr ähnlich; Dlx5 "Knock out"-Mäuse zeigen schwere Mißbildungen der Bogengänge, die an den Phänotyp der Nkx5-1-/--Mäuse erinnern. Ich habe die Expression von Nkx5-1 in mutanten Dlx5-Ohren und umgekehrt untersucht und gezeigt, daß die Expression beider Gene voneinander unabhängig ist.
Ein Kandidaten-Zielgen von Nkx5-1 ist BMP4, da die BMP4-Expression in Nkx5-1-/- Ohren herabgesetzt ist. Um herauszufinden, ob Nkx5-1 in der Lage ist, BMP4-Expression zu induzieren, habe ich zfNkx5-1 mRNA in Medakaembryonen im Zweizellstadium injiziert. Tatsächlich ist die BMP4-Domäne auf der injizierten Seite deutlich verstärkt. Zusätzliche Effekte der Nkx5-1-Injektionen erfordern hier jedoch weitergehende Untersuchungen.

Nkx5-1 is a transcription factor expressed early during the inner ear development, and it is necessary for the formation of semicircular canals. Evolution of the Nkx5 family of genes, and functional properties of the Nkx5-1 protein, were investigated in the presented work. Five previously identified medaka Nkx5 genes were characterized by obtaining their full genomic and coding sequences, and by analysis of their expression patterns. Phylogenetic analysis of Nkx5 family members revealed the existence of four paralogous groups of Nkx5 genes in the vertebrate genome, and only one in invertebrate species. In medaka genome representatives of all four groups are present (in contrast to other vertebrates, were some Nkx5 genes have been lost or still await discovery), and the Nkx5-1 gene is represented by two paralogs. This situation is in line with recent hypotheses postulating genome duplications in the evolutionary history of vertebrates. The obtained data led me to propose a model of evolutionary history of this ancient group of genes.
In the zebrafish FGF8 mutant, acerebellar (ace), ear placodes and vesicles are strongly diminished, and ear expression of several transcription factors is downregulated in comparison to wild type. I isolated the zebrafish Nkx5-1 cDNA, and studied its expression in wild type and ace embryos. It appeared that zfNkx5-1 is strongly downregulated in the ace otic placodes and vesicles. Subsequently I studied effects of the ectopic FGF source on expression of Nkx5-1 and other ear transcription factors, using chicken as a model system. The experiment proved that additional FGF source can activate expression of Nkx5-1, SOHo and Pax2 genes, while slightly downregulating Dlx5 expression. Additionally, FGF2 sources were able to induce ectopic ear structures. In chicken embryos FGF8 is transiently expressed in the anterior part of the placode, at time and place suggesting that FGF8 might regulate Nkx5-1 expression.
In the mouse and chicken ear Dlx5 pattern of expression is very similar to Nkx5-1 pattern; the Dlx5 KO mice show strong semicircular canals malformations, very much alike Nkx5-1 -/- mice. I studied the expression of Nkx5-1 in the Dlx5 mutant ears and vice versa, and expression of both genes appeared to be mutually independent; this result suggests that Nkx5-1 and Dlx5 do not regulate each other's expression.
One of the candidate genes for the Nkx5-1 target is BMP4, since in the Nkx5-1 -/- ear it is downregulated. To find out whether Nkx5-1 is able to induce BMP4 expression, I injected zfNkx5-1 mRNA into the two cell medaka embryos. Indeed, the BMP4 domain is much stronger at the injected site, however, additional effects of the Nkx5-1 injections demand a further investigation.

Keywords:
Ohrentwicklung, Homöoboxgene, Genomevolution, FGF Signalübertragung, Medaka, Zebrafisch

ear development, homeobox genes, genome evolution, FGF signaling, medaka, zebrafish

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Inhaltsverzeichnis
Content (I-III)
1 Introduction (1-13)
2 Results (14-47)
3 Discussion (48-60)
4 Experimental procedures (61-80)
5 References (81-92)
6 Appendix (93-95)