Tanja Bloß

Charakterisierung von CDF-Transportern aus Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe und Arabidopsis thaliana

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt an der Mathematisch-Naturwissenschaftlich-Technischen Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 19.04.2001

Abstract
Metalltoleranz und -Homöostase in Pflanzen wird durch kontrollierten Metalltransport sowie Sequestrierung der Metalle vermittelt. Dies erfolgt durch spezifische Metall-bindende Proteine, wie Phytochelatine, Chaperone oder Metallothioneine.
Die Proteinfamilie der Cation Diffusion Facilitator vereint Metall-Transporter, die im gesamten Artenreich vorhanden sind. Die ersten Vertreter dieser Familie waren CzcD aus dem gram-negativen Bodenbakterium Ralstonia metallidurans Stamm CH34 und Zrc1p aus der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae. Beide Proteine sind in den Transport und die Regulation der Metallhomöostase involviert.
Der Zink-Transporter Zat1p aus Arabidopsis thaliana ist der erste pflanzliche Vertreter der CDF-Proteinfamilie.
Nach heterologer Expression von ZAT1 in Escherichia coli konnte die Bindung von Zink an das Zat1p Protein mittels Zink-Blot nachgewiesen werden. Diese Zink-Bindung erfolgt innerhalb der hydrophilen, histidinreichen Domäne zwischen H182 und H232. Das Zat1p Protein ist in der Membran lokalisiert und bildet Dimere.
Ein Gemisch der Proteine Zat1p und Zat1p*(M1-I25) wurde gereinigt und in Detergenz destabilisierten Liposomen rekonstituiert. Die Aufnahme von Zink in die Proteoliposomen ist unabhängig von einem Protonengradienten und wird nur durch den Zink-Konzentrationsgradienten über der Membran angetrieben. Zat1p transportiert kein Cobalt, während die Cadmium-Aufnahme ungefähr 1 % der Zink-Transport-Rate entspricht.
Zat1p fungiert als Zink-Aufnahme-System in 2 Stämmen des Bakteriums Ralstonia metallidurans, die sich in ihrem Gehalt an Zink-Efflux-System unterscheiden.
Das ZAT1 Gen ist nicht in der Lage, die Zink-Sensitivität einer zrc1 Einzel- oder einer zrc1cot1 Doppelmutante der Hefe Saccharomyces cerevisiae aufzuheben.

Metal tolerance and homeostasis in plants is reached by controlled transport processes in connection with sequestration by specific metal-binding components like phytochelatins, metallo-chaperones and metallothioneins.
Cation diffusion facilitators are a family of metal transport proteins which have been found in a variety of organisms. The first examples were the CzcD protein from the Gram-negative bacterium Ralstonia metallidurans strain CH34 and Zrc1p from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Both proteins are transporters also involved in regulation of metal ion homeostasis.
The Zat1p zinc transporter from Arabidopsis thaliana is the first CDF protein from plants. When heterologously expressed in Escherichia coli, Zat1p bound zinc in a metal blot and formed dimers only present in the membrane. Binding of zinc occured mainly to a hydrophilic amino acid stretch from H182 to H232. A Zat1p/Zat1p*(M1-I25) mixture of the protein was purified and reconstituted into proteoliposomes. Uptake of zinc into the proteoliposomes did not require a proton gradient across the liposomal membrane. Zat1p did not transport cobalt, and cadmium only at 1% of the zinc transport rate.
Zat1p functioned as uptake system for 65Zn2+ in two strains of the Gram-negative bacterium Ralstonia metallidurans, which were different in their content of zinc efflux systems.
The ZAT1 gene did not rescue increased zinc sensitivity of a zrc1 single or of a zrc1cot1 double mutant strain of Saccharomyces cerevisiae.

Keywords:
Zink, Cadmium, Cobalt, Schwermetallresistenz, Metalltransport, Bakterien Hefen, Pflanzen

zinc, cadmium, cobalt, heavy metal resistance, metal transport, bacteria, yeast, plants

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Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis, Abkürzungsverzeichnis (I-VIII)
1. Einleitung (1-6)
2. Material und Methoden (7-56)
3. Experimente und Ergebnisse (57-97)
4. Diskussion (98-122)
5. Zusammenfassung (123-124)
6. Literaturverzeichnis (125-139)