Robert Augustin

Entwicklungsspezifische Expression und mögliche funktionelle Bedeutung der Glukosetransporterisoformen in Präimplantationsembryonen des Rindes

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt an der Mathematisch-Naturwissenschaftlich-Technischen Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 27.06.2001

Abstract
Glukose ist essentielles Energiesubstrat für die Präimplantationsentwicklung von Säugetierembryonen. Die Aufnahme von Glukose in die Zelle erfolgt über Transmembranproteine - die Glukosetransporter - durch aktive (SGLT) und passive (Glut) Mechanismen. Verschiedene Isoformen der Glukosetransporter-Familie können anhand der Primärstruktur, spezifischer Transportkinetiken und dem Gewebeexpressionsmuster unterschieden werden. Insulin beeinflusst den Glukosetransport durch Regulation der Glukosetransporterexpression und -translokation.
Die vorliegende Arbeit untersuchte das Expressionsmuster von Glukosetransporterisoformen (Glut1-5 und 8) und dem aktiven Transporter SGLT-I in Präimplantationsembryonen des Rindes von der Eizelle bis zum Stadium der 16 Tage alten, elongierten Blastozyste. Bisher nicht bekannte bovine Glukosetransporter-cDNA der Isoformen 2, 3, 5 und 8 und des SGLT-I wurden kloniert. In vitro und in vivo gewachsene 14 und 16 Tage alte Blastozysten wurden bezüglich der Expression der Glukosetransporter 1 und 4 durch RNA-Quantifizierung verglichen. Die Isoformen Glut1 und Glut4 in Rinderblastozysten wurden mittels Immunhistochemie lokalisert. An 8 Tage alten Blastozysten wurden Kurzzeiteffekte von Insulin (1, 2 und 4 Stunden nach Insulin-Supplementierung) auf die Transkription von Glut1, 3, 8 und die Glykolyseenzyme Hexokinase und Phosphofruktokinase untersucht. Mitogene Langzeiteffekte des Insulins (am Ende der ca. 168stündigen In-vitro-Kultur) wurden anhand von Kriterien wie Blastozystenrate, Rate der geschlüpften Blastozysten, Zellzahl und Bestimmung des TE/ICM-Zellzahlverhältnisses betrachtet.
Es konnte gezeigt werden, daß Glukosetransporterisoformen in Präimplantationsembryonen des Rindes stadienspezifisch exprimiert werden. Transkripte der Isoformen 1, 3, 8 und SGLT-I sind maternalen und embryonalen Ursprungs und waren in allen untersuchten Embryonalstadien nachweisbar. Der Glut5 wird mit dem Beginn der Aktivierung des embryonalen Genoms ab dem 8-/16-Zellstadium transkribiert. Die mRNA der Glukosetransporter 2 und 4 ist im Blastozystenstadium nachweisbar. Glut4-Transkripte sind bereits in expandierten Blastozysten, von Glut2 hingegen erst in den untersuchten elongierten Stadien (14 und 16 Tage alt) zu finden. Die Quantifizierung von Glut1- und Glut4-RNA in 14 und 16 Tage alten in vitro und in vivo gewachsenen Embryonen wies eine verringerte Expression des Glut4 und erhöhte Transkriptmengen für den Glut1 in 16 Tage gegenüber 14 Tage alten Blastozysten nach. In 16 Tage alten in vivo Embryonen wurden keine Glut4-Transkripte detektiert, während eine schwache Expression dieses Transporters in in vitro Embryonen gleichen Stadiums vorliegt, was auf eine Entwicklungsverzögerung in vitro kultivierter Embryonen zurückzuführen sein könnte. Das Glut1-Protein wurde in expandierten 8 Tage alten und in elongierten 14 und 16 Tage alten Blastozysten nachgewiesen. Es wurde im Zytoplasma und den lateralen Membranen der Trophektodermzellen lokalisiert. Embryoblastzellen exprimieren das Glut1-Protein ebenfalls, Endodermzellen nicht. Das Glut4-Protein wurde immunhistochemisch in 14 und 16 Tage alten Blastozysten in den Embryoblastzellen zytoplasmatisch und in den Endoderm- und Trophektodermzellen nukleär lokalisiert. Insulin beeinflußt die mRNA-Expression von Glukosetransporterisoformen und Glykolyseenzymen in 8 Tage alten Blastozysten. Eine einstündige Insulinexposition der Embryonen resultierte in erhöhten Transkriptmengen von Glut3, 8, Hexokinase und Phosphofruktokinase. Die Insulinsupplementierung des Kulturmediums während der In-vitro-Kultur hatte keinen Einfluß auf die Transkription der Gene Glut1, 3, 8, Hexokinase und Phosphofruktokinase. Die In-vitro-Kultur von Rinderembryonen unter Insulingabe resultierte in erhöhten Blastozystenzellzahlen und Raten geschlüpfter Blastozysten. Insulin hatte in der vorliegenden Studie somit einen metabolischern Kurzzeiteffekt auf die Transkription einiger Gene und eine mitogenen Langzeiteffekt.
Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen ein spezifisches Expressionsmuster von Glukosetransporterisofomren während der Präimplantationsentwicklung von Rinderembryonen, was eine spezifische Regulation und Funktion der einzelnen Isoformen während der frühen Embryonalentwicklung schließen lässt.

Glucose is an essential energy substrate for mammalian preimplantation embryo development. Glucose transport across plasma membranes is mediated by two different mechanisms: by an active, sodium-dependent transport (SGLT) which couples glucose uptake with Na/ influx against a concentration gradient, and by passive energy independent transport via facilitative glucose transporters (Glut). Different glucose transporter isoforms exist that share common structure features and differ in their substrate affinity and show a tissue specific expression pattern. Insulin effects glucose transport altering glucose transporter expression and - translocation.
The recent work investigated the expression pattern of facilitative glucose transporters (Glut1-5 and 8) and sodium-dependent-glucose transporter (SGLT-I) in bovine oocytes and preimplantation embryos up to d16 of development. Previous unknown bovine specific glucose transporter cDNA (Glut2, 3, 5, 8 and SGLT-I) were cloned and sequenced. Elongated 14 and 16 days old blastocysts derived in vitro or in vivo were compared for their mRNA-expression of the isoforms 1 and 4 using a competitive RT-PCR approach. The isoforms Glut1 and Glut4 were localised in bovine blastocysts by immunohistochemistry. In 8 days old expanded blastocysts short time effects of insulin (1, 2 and 4 hours) on the transcription for Glut1, 3, 8 and the glycolytic enzymes hexokinase and phosphofructokinase were investigated. Long term effects of insulin (after 168 hours of in vitro culture) on the transcription of glucose transporters and glycolytic enzymes and embryo culture criteria such as blastocyst and hatching rate, blastocyst cell number and ratio of trophectoderm to embryoblastcells were determined.
It was shown, that glucose transporters are developmentally expressed in bovine preimplantation embryos. Transcripts for the isoforms 1, 3, 8 and SGLT-I are of maternal and embryonic origin and were found to be expressed in all stages investigated. Glut5 transcription starts with the beginning of the embryonic genome activation at the 8-/16-cell stage. The mRNA expression for Glut2 and Glut4 is restricted to the blastocyst stage. While Glut4 transcripts were detected in 8 days old expanded blastocysts, Glut2 expression was found only in the elongated 14 and 16 days old embryos. The mRNA quantification for Glut1 and Glut4 in 14 and 16 days old in vitro and in vivo derived elongated blastocysts showed an increased Glut1 expression in 16 compared with 14 days old embryos, while Glut4 expression decreased. In 16 days old in vivo derived embryos no Glut4 expression was detectable. Compared to in vivo embryos a weak expression of this isoform in in vitro grown embryos may indicate a delayed development of these embryos. Glut1 protein was localised by immunohistochemistry in 8 days and 14 and 16 days old elongated blastocysts in the cytoplasm and the lateral membranes of trophectoderm cells. Embryoblastcells show Glut1 expression, while endodermcells do not express the Glut1 protein. The Glut4 protein was localised by immunohistochemistry in 14 and 16 days old elongated blastocysts. In embryoblastcells Glut4 was localised in the cytoplasm, while endoderm- and trophectodermcells showed a nuclaer staining. Short time exposure of blastocyst to insulin increased the gene expression of Glut3, 8, hexokinase and phosphofructokinase in a time dependent manner. Insulinsupplementation (10g/mL) of embryo culture media did not have long term effects on the mRNA expression of Glut1, 3, 8 and hexokinase and phosphofructokinase. Blastocysts obtained from in vitro culture under insulinsupplementation did result in higher blastcyst cell number and hatching rates. These data suggest a metabolic short time and mitogenic long term effect of insulin on in vitro derived bovine embryos. The results of this study show a distinct expression pattern for glucose transporters during bovine embryo development indicating specialised regulation and functions for these isoforms at different developmental stages in bovine embryos.

Keywords:
Glukosetransporter (Glut), Präimplantationsentwicklung, Rinderembryonen, Insulin, Expression

glucose transporter (Glut), preimplantation development, bovine embryos, insulin, expression

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Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis (I-III)
1 Einleitung (1-20)
2 Material und Methoden (21-41)
3 Ergebnisse (42-69)
4 Diskussion (70-91)
5 Zusammenfassung (92-94)
6 Summary (95-97)
7 Anhang (98-103)
8 Abkürzungsverzeichnis (104-105)
9 Literaturverzeichnis (106-119)