Andreas Anton

Genetische und biochemische Charakterisierung von CzcD und anderen Regulatoren der czc-vermittelten Schwermetallresistenz in Ralstonia metallidurans

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt an der Mathematisch-Naturwissenschaftlich-Technischen Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 23.11.2001

Abstract
Die czc-Determinante von Ralstonia metallidurans CH34, die auf dem Megaplasmid pMOL30 lokalisiert ist, vermittelt Resistenz gegenüber den Schwermetallen Kobalt, Zink und Kadmium durch aktiven Efflux dieser Kationen. Der membrangebundene Effluxkomplex setzt sich dabei aus den Proteinen CzcA, der zentralen Pumpe, die als Protonen/Kationen-Antiporter fungiert, dem MFP CzcB und dem OMF CzcC zusammen. Durch den Gesamtkomplex werden die Schwermetallionen mittels des Transenvelope-Transports über beide Membranen aus dem Zytoplasma direkt ins Außenmedium geschleust.
Als einer der ersten beschriebenen Vertreter der CDF-Proteinfamilie vermittelt CzcD unabhängig eine geringe Schwermetallresistenz und beeinflusst dadurch auch die Induktion des CzcCBA-Efflux-Komplexes. Die Deletion von czcD führte zum teilweisen Verlust der Schwermetallresistenz. Gleichzeitig erhöhte sich die Grundexpression des czcCBA-Operons.
CzcD allein vermittelte erhöhte Zn2+-Resistenz im sensitiven E. coli-Stamm GG48 durch verminderte intrazelluläre Akkumulation der Schwermetallionen. CzcD transportierte spezifisch Zn2+ und Cd2+, jedoch nicht Co2+ und Ni2+. Durch die Hemmung des Transportes mit FCCP wurde der Nachweis erbracht, dass der Transport von einem Protonengradienten abhängig ist. Drei konservierte Aspartat-Reste im transmembranen Kanal von CzcD wurden in Asparagin-Reste umgewandelt und ihr Einfluss auf die Transportaktivität untersucht.
Polyklonale Anti-CzcD-Antikörper wurden im Kaninchen erzeugt. Die Induktion des nativen Proteins durch Zn2+, Co2+ und Cd2+ konnte mittels dieser Antikörper nachgewiesen werden.
Durch Proteaseverdaue mit Trypsin und Metall-Chelat-Chromatographie konnte nachgewiesen, dass CzcD Zn2+, Co2+, Cu2+ und Ni2+, jedoch nicht Cd2+ in vitro bindet. Die Bindung erfolgte durch die Histidine im Protein, was durch chemische Modifikation von CzcD mit DEPC und durch die Wiederherstellung der Bindung mit Hydroxylamin nachgewiesen werden konnte. Mindestens eine Metallbindestelle befand sich dabei im C-Terminus des Proteins.
Chemische Quervernetzung mit Glutardialdehyd zeigte die Oligomerisierung von CzcD. Durch die Inkubation mit Tris-2,2'-bipyridylruthenium(II)chlorid konnte die Bildung von CzcD Dimeren nachgewiesen werden.

The czc-determinant of Ralstonia metallidurans CH34, which is localized on the Megaplasmid pMOL30, mediates resistance to cobalt, zinc and cadmium by active efflux of these cations. The membran-bound efflux complex assemble themselve from the proteins CzcA, to the central pump, which functions as a protone/cation antiporter, the MFP CzcB and the OMF CzcC. The heavy metal ions are transported by transenvelope transport over both membranes from the cytoplasm directly into the external medium.
As one of the first described representatives of the CDF-proteinfamily, CzcD mediates a small heavy metal resistance independently and influence by that also the induction of the CzcCBA Efflux complex. The deletion of czcD led to a partial loss of the heavy metal resistance. At the same time the basic expression czcCBA operon was increased. CzcD alone mediates increased Zn2+-resistance in the sensitiven E. coli strain GG48 by reduced intracellular accumulation of the heavy metal ions. CzcD transported specifically Zn2+ and Cd2+, however not Co2+ and Ni2+. By the inhibition of the transport with FCCP the proof was furnished that the transport is dependent on a proton gradient. Three conserved Aspartat residues in the channel of CzcD were converted into asparagine residues and their influence on the activity have been investigated.
Polyclonal anti-CzcD antibodies were produced in a rabbit. The induction of the native protein by Zn2+, Co2+ and Cd2+ could be shown by these antibodies. By digestion with trypsine and metal chromatography it could be shown that CzcD binds Zn2+, Co2+, Cu2+ and Ni2+, however not Cd2+ in vitro. The binding took place via the histidines residues in the protein, which could be proven by chemical modification of CzcD by DEPC and by the recreation of the binding with hydroxylamin. At least one metal binding place was thereby in the c-term of the protein.
Chemical crosslinking with Glutardialdehyde showed the oligomerisation of CzcD. By the inkubation with Tris-2,2'-bipyridylruthenium(II)chlorid the dimerization of CzcD could be proven.

Keywords:
Ralstonia metallidurans, czc, Schwermetallresistenz, CDF-Protein, Membranprotein, Schwermetalltransport, Efflux, Chemische Modifikationen, Proteinreinigung

Ralstonia metallidurans, czc, heavy metal resistance, CDF-protein, membrane-protein, heavy metal transport, active efflux, chemical modificatons, protein purification

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Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis, Abkürzungsverzeichnis (I-IX)
I. Einleitung (1-7)
II. Material und Methoden (8-52)
III. Ergebnisse (53-94)
IV. Diskussion Teil (95-126)
V. Zusammenfassung (127-128)
VI. Literaturverzeichnis (129-149)