Cornelia Göbel

Untersuchungen zur Funktion von Oxylipinen bei der Pathogenantwort in Solanum tuberosum L.

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt an der Mathematisch-Naturwissenschaftlich-Technischen Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 05.12.2001

Abstract
Lipoxygenasen (LOXen) sind an der pflanzlichen Antwort auf Pathogenbefall beteiligt. Sie katalysieren die Dioxygenierung vielfach ungesättigter Fettsäuren und somit die Synthese von Hydroperoxid-Derivaten, die durch die Enzyme des LOX-Reaktionsweges unter anderem zu Signalmolekülen und antimikrobiellen Verbindungen umgesetzt werden. In Zellen von S. tuberosum erfolgt nach Behandlung mit einer Rohelicitorpräparation von P. infestans die präferentielle Stimulierung von 9-LOXen sowie die Akkumulation des Divinylethers Colnelsäure, einer Verbindung mit antifungaler Wirkung, von Trihydroxid-Derivaten (9,10,11-TriHOE und 9,10,11-TriHOD) und des Hydroxid-Derivates 9-HOD. Die Metabolisierung von 9-LOX-Produkten ist ebenfalls in Blättern von S. tuberosum bei der kompatiblen Interaktion mit P. infestans und der Nichtwirt-Pathogen-Interaktion mit Pseudomonas syringae pv. maculicola (Psm) stimuliert. Am stärksten ist die Synthese der Trihydroxide 9,10,11-TriHOD und 9,12,13-TriHOD aktiviert, die als antifungale Substanzen diskutiert werden. Parallel akkumulieren in geringeren Mengen auch das Hydroxid-Derivat 9-HOT und die Divinylether Colnelsäure (CA) und Colnelensäure (CnA). Die Stimulierung des 9-LOX-Reaktionsweges erfolgt parallel zur Verbräunung der Zellen bzw. der Ausprägung von Nekrosen auf den pathogenbehandelten Blättern. Ein Zusammenhang zwischen der Nekrosebildung und der Akkumulation von 9-LOX-Produkten wurde anhand chemisch induzierter (nach Eosinbehandlung) und durch Infiltration mit dem Oligopeptidelicitor Pep13 verursachter Nekrosen untersucht. Hinweise auf die Funktion der Oxylipine bei Abwehrreaktionen in S. tuberosum wurden in gain of function-Experimenten durch exogene Applikation von LOX-Metaboliten-Lösungen erhalten. Diese Oxylipine könnten direkt an der Induktion von Abwehrreaktionen beteiligt sein. Zur Untersuchung der pathogeninduzierten Expression von 9-LOX-Genen wurde das posttranskriptionelle gene silencing (PTGS) durch RNA-Doppelstrang-Interferenz (RNAi) für die Pflanzentransformation verwendet. In den transgenen Pflanzen ist die Expression aller bekannten 9-LOXen aus S. tuberosum unterbunden. Erste Analysen der Metabolite des LOX-Reaktionsweges zeigen, daß in den RNAi-Pflanzen ein verändertes Oxylipin-Muster vorliegt, dessen Funktion aber noch näher charakterisiert werden muß.

Lipoxygenases (LOXs) catalyze the dioxygenation of polyunsaturated fatty acids and consequently the synthesis of hydroperoxy derivatives, which are converted by a multitude of enzymes into signalmolecules and antimicrobial compounds, among others. These derivatives are involved in the plant pathogen defense. In potato cells, the 9-LOX pathway is preferentially stimulated after treament with a preparation of crude elicitor from Phytophthora infestans. The main metabolites are the divinylether colneleic acid, which exhibits antimicrobial activity, the trihydroxy derivatives 9,10,11-TriHOE and 9,10,11-TriHOD as well as the hydroxy derivative 9-HOD. 9-LOX reactions are also stimulated in potato leaves, in the compatible interaction with P. infestans and in the non-host pathogen interaction with Pseudomonas syringae pv. maculicola. The trihydroxy derivatives 9,10,11-TriHOD and 9,12,13-TriHOD are the most prominent oxylipins. An antifungal activity is suggested for these compounds. In parallel, the hydroxy derivative 9-HOT and the divinylethers colneleic acid (CA) and colnelenic acid (CnA) also accumulate in both systems but to lower amounts. The stimulation of the 9-LOX pathway occurs in parallel to browning of the cells or the development of necroses on the pathogen-treated leaves. After treatment with the photodynamic substance eosin, the 9-LOX metabolites 9,10,11-TriHOD and 9,12,13-TriHOD as well as 9-HOT accumulate in temporal correlation with the development of necroses. "Gain-of-function" experiments, in which the exogenouse application of solutions of LOX metabolites were investigated in a concentration dependent manner, demonstrated the correlation of stimulation of the LOX activity and the activation of defense reactions. All this leads to the conclusion that these oxylipins may be directly involved in the induction of defense reactions. To analyze the pathogen-induced expression of 9-LOXs, posttranscriptional gene silencing via interference of double-stranded RNA (RNAi) was used. Expression of all known 9-LOXs from potato is inhibited in transgenic plants. Apart from an amplification of autoxidative processes a pathogen-induced accumulation of free fatty acids and divinylethers occurred in some RNAi plants but could not be correlated to increased resistance.

Keywords:
Solanum tuberosum, lipoxygenase pathway, oxylipin profiling, Phytophthora infestans, Pseudomonas syringae pv. maculicola, trihydroxy fatty acids, divinyl ether, RNAi

Solanum tuberosum, Lipoxygenase-Reaktionsweg, Oxylipinprofil, Phytophthora infestans, Pseudomonas syringae pv. maculicola, Trihydroxyfettsäuren, Divinylether, RNAi

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Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis, Abkürzungen
A Einleitung (1-16)
B Material und Methoden (17-37)
C Ergebnisse (38-70)
D Diskussion (71-86)
E Zusammenfassung (87-88)
F Literaturverzeichnis (89-104)
G Anhang (105-106)