Nasser Abbas

Parthenogenesis in plants: Putative functions of MCM genes

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt an der Mathematisch-Naturwissenschaftlich-Technischen Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 20.02.2002

Abstract
Die Kontrolle und Nutzung apomiktischer Samenbildung wird als eines der herausragenden Ziele der Pflanzenzüchtung und Produktion eingestuft. Gleichzeitig stellt die Aufklärung der zellulären und molekularen Vorgänge beim Übergang zwischen Sporophyt und Gametophyt und umgekehrt eine Herausforderung für die Grundlagenforschung dar.
Apomixis umfasst in Wesentlichen drei Komponenten: Vermeidung der Meiose (Apomeiose, Diplosporie), befruchtungstunabhängige Initiation der Endospermbildung (Parthenkgenese) sowie die teilweise befruchtungstunabhängige Endospermbildung.
Das aus drei isogenen Weizenlinien bestehende "Salmon-System" repräsentiert unikales Ausgangsmaterial zum Studium der Parthenkgenese als eine Komponente der Apomixis. Während eine Linie sich rein sexuell vermehrt, erfolgt die Initiation der embryogenesen in den beiden anderen Linien befruchtungstunabhängig durch Parthenkgenese. Verbuche an isolierten, in vitro kultivierten Eizellen zeigen, dass dies eine Eizelle-inhärente Eigenschaft ist.
Arbeiten zur Isolierung von Genen mit differentieller Expression in den Gynoecien der sexuellen versus der parthenkgenetischen Linien führten zur Identifikation von Genen der MCM-Familie. MCM stht für mini chromosome mainentance. Entsprechende Gene wurden zunächst in Hefe beschrieben. Homologe mit hochkonservierter Struktur finden sich aber in allen untersuchten Organismen. MCM-proteine bilden einen hexameren Komplex und sind im Zellzyklus währed des G1/S Übergangs an der Initiation der DAN-Replikation beteiligt.
Die Charakterisierung eines in parthenogenetischen Weizen-Gynocien bevorzugt exprämierten MCM2-gen (TaMCM2) betrifft zunächst die Aufklärung der komplexen Exon-Intron-Struktur sowie die Isolierung der Promotorregion. Promotor-Reortergen-Konstruktionen wurden in Arabidopsis transformiert und zeigen komplex Expressionsmuster. Für eine weiterführende Charakterisierung, insbesondere durch die Erzeugung von spezifischen Antikörpen, wurde das TaMCM2-Gen in verschiedenen bakteriellen Expressionssystemen exprämiert sowie Antikörper erzeugt und zur Detektion des Proteins eingesetzt.für eine funktionelle Analyse des TaMCM2-Gens wurden Versuche zur Komplementration der mcm2-Hefemutantte durchgeführt. Offfensichtlich kann das Pflanzen-Gen die Mutante nicht komplementieren. Darüber hinaus wurden durch subtraktive Hybridvisierungsverfahren Kandidaten für Embryosack-spezifischen Gene isoliert. Schließlich wurden unter Nutung eines Embryosack-spezifischen Genpromoters verschiedene MCM-Gene aus Weizen, Mais und Ackerbohne (TaMCM2, VfMCM2, ZmMCM6) in transgenen Arabidopsis-Pflanzen untersucht. Parallel dazu wurde das Embryogenese-induzierende Leafy Cotyledon (LEC1)-Gen für diese Versuche eingesetzt. Eine eingehende embryologische Auswertung dieser Pflanzen ist noch in Arbeit.

The TaMCM2 gene of wheat has been cloned and the genomic structure has been determined.
A TaMCM2 promoter GUS construct was transformed into Arabidopsis and shows preferential activity in flowers at anthesis.
Polyclonal antibodies against E. coli expressed TaMCM2 protein have been generated used for detection and cellular localisation.
Although MCM2 proteins are highly conserved, plant MCM2 genes do not complement a corresponding mcm2 yeast mutant.
Plant MCM genes as well as the TF gene LEC1 have been expressed in Arabidopsis under the control of two versions of the embryo sac-specific promoter RB1/2. A more detailed embryological analysis is in progress.
Close to one hundred transgenic Arabidopsis lines need a further detailed molecular and embryological examination. A new egg cell specific gene promoter (pRB22) will be manipulated as a suitable binary vector for the analysis of egg cell specific genes which were isolated for instance from egg cell specific libraries of sexual and parthenogenetic lines.

Keywords:
Pflanzen parthenogenese, MCM Gene, Hefe Komplementation, Flow Cytometer assay, Embryosack-spezifische Gene, subtractive hypridization, polyclonal Antikörper gegen MCM2 protein

Plant parthenogenesis, MCM genes, yeast complementation test, flow cytometer assay, embry sac specific genes, subtractive hypridization, polyclonal antibodies against MCM2 protein

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Inhaltsverzeichnis
Contents, Abbreviations (I-V)
1. Introduction (1-18)
2. Material (19-25)
3. Methods (26-37)
4. Results (38-83)
5. Discussion (84-96)
Conclusions, Zusammenfassung (97-99)
References (100-110)
Appendix