Frank Bartel

Molekulare Charakterisierung von HDM2 (MDM2) in Weichteilsarkomen - Bedeutung als Prognosefaktor und Ziel innovativer Therapiestrategien

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt an der Mathematisch-Naturwissenschaftlich-Technischen Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 13.03.2002

Abstract
Weichteilsarkome stellen eine seltene, aber sehr heterogene Tumorgruppe dar. Es ist schwierig, genaue Aussagen über die Prognose oder den Verlauf einer Therapie zu treffen. In der vorliegenden Arbeit wurden Weichteilsarkome (WTS) daher umfassend molekulargenetisch charakterisiert. Dabei stand die Analyse insbesondere der für WTS bedeutsamen Tumorsuppressorproteine TP53 und p14ARF sowie des Onkoproteins MDM2 in Bezug auf Alterationen der Expression bzw. auf Genebene (Überexpression, Genamplifikation, Mutationen, Mikrosatelliteninstabilitäten) im Vordergrund. Es konnte gezeigt werden, dass 55 % der WTS-Proben zusätzlich zum MDM2-"full-length"-Transkript verkürzte Spleißvarianten exprimieren. Insgesamt wurden 20 verschiedene Transkripte identifiziert (16 davon erstmals im Rahmen dieser Arbeit). Das Auftreten der MDM2-Spleißformen korrelierte mit einem höheren Tumorgrad der WTS, ein Einfluss auf die Prognose von WTS-Patienten konnte jedoch nicht nachgewiesen werden. Es wird vermutet, dass bestimmte Formen zur Bildung und Progression von Tumoren, einschließlich WTS, beitragen. Der im Rahmen dieser Arbeit entwickelte "Splice Capture Assay" (SCA) ermöglicht eine schnelle und kostengünstige Analyse bislang unbekannter Spleißformen durch den Vergleich der charakteristischen Spaltmuster nach dem Verdau der PCR-Produkte mit bestimmten Restriktionsenzymen. Durch die Zuordnung der einzelnen Fragmente lässt sich ohne Sequenzierung die Struktur einer unbekannten MDM2-Spleißform sehr genau vorhersagen. Die Amplifikation des MDM2-Gens konnte in 28 % der untersuchten WTS detektiert werden. Überraschenderweise war die MDM2-Genamplifikation mit einer guten Prognose für WTS-Patienten verbunden. Die mittlere Überlebenszeit ohne Amplifikation betrug etwa 50 Monate, im Vergleich zu 80 Monaten für WTS-Patienten mit nachgewiesener MDM2-Amplifikation. Der Verlust der p14ARF-mRNA-Expression betraf 14 % der WTS-Patienten. Dies war jedoch mit einer stark verkürzten mittleren Überlebenszeit verknüpft (11 Monate ohne vs. 96 Monate mit p14ARF-mRNA-Expression). Sowohl die MDM2-Genamplifikation als auch die p14ARF-mRNA-Expression erwiesen sich in der COX-Regressionsanalyse als unabhängige prognostische Marker für WTS-Patienten. Einen weiteren Schwerpunkt bildete die Durchführung von MDM2-Antisense-Therapiestudien an WTS-Xenotransplantaten im nu/nu-Rattenmodell. In diesen in vivo-Experimentenkonnte nach einer Behandlungszeit von einer Woche die Tumormasse um bis 71 % reduziert werden. Des Weiteren wurde erstmals gezeigt, dass auch die Zahl der Tumoren, die sich gebildet hatten, in den mit MDM2-AS-ODNs behandelten Tieren signifikant kleiner als in den Kontrollgruppen war. Erwartungsgemäß führte die Behandlung der Tumoren mit MDM2-AS-ODNs zu einer Reduzierung der MDM2-Proteinmenge. Interessanterweise war zusätzlich auch die Menge an mt-TP53 in den Behandlungsgruppen stark vermindert. Diese Ergebnisse haben eine große allgemeine Bedeutung für die Behandlung von Tumoren mit MDM2-AS-ODNs, da nachgewiesen werden konnte, dass eine Reduzierung der Tumormasse und der Tumorzahl unabhängig vom TP53-Genstatus möglich ist.

Soft tissue sarcomas (STSs) are a relatively rare tumour type, but they are characterized by high heterogeneity. It is difficult to predict the patientsí outcome and survival time. Therefore, STSs were comprehensively analysed according to the gene and expression status of various tumour suppressor and oncogenes, e.g. MDM2, TP53, p14ARF and others. We could show that alternatively as well as aberrantly spliced transcripts of the MDM2 mRNA were expressed in 55% of the tumour samples in addition to the full-length mRNA. In total, 20 different transcript variants have been identified. Of these, 16 have been described here for the first time. The expression of MDM2-splice variants is correlated to a more malignant phenotype in STS, but there was no impact on the patientsí overall survival time. We suggest that only certain isoforms contribute to tumorigenesis, whereas others do not. Unknown transcript variants have been characterized by a newly developed "Splice Capture Assay (SCA)". The SCA allows the rapid analysis of splice variants by simply comparing the restriction pattern obtained with selected restriction enzymes to that of known isoforms without sequencing. Of our STS samples, 28% contained an amplified MDM2 gene. Surprisingly, the MDM2 gene amplification was correlated to a prolonged survival time. Furthermore, a Cox-regression analysis revealed that the amplification of the MDM2 gene is an independent positive prognostic factor for STS (RR=4.4; p=0.17). The loss of ARF mRNA and protein expression was detected in 14% of the cases. This was significantly correlated to a shortened survival time for STS patients (11 vs. 96 months, p=0.0001, log-Rank-test). In summary, here we show that both the MDM2 gene amplification and the loss of p14ARF expression are independent prognostic markers for STS. Despite the contracting data regarding the prognostic value of MDM2 in STS, MDM2 has been considered as a target for a molecular therapeutic approach. We could show that the use of MDM2-antisense-oligonucleotides significantly reduces the tumour mass and the tumour number in an xenotransplant nu/nu-rat model compared to a sense-oligonucleotide and a saline control group. As expected, the amount of MDM2 protein was decreased in the tumours which have been treated with MDM2-antisense-oligonucleotides. Furthermore, we show for the first time, that the treatment with MDM2-antisense-oligonucleotides has an impact on the amount of mutant-TP53 which was significantly lower in the antisense-treated groups than in the control groups. These finding suggests that the MDM2-antisense-therapy acts independent from the TP53 mutational status, what might have an general impact on the treatment of cancer.

Keywords:
MDM2, alternatives Spleißen, Weichteilsarkome, Prognose, Amplifikation, p14ARF, Tiermodell, Adenovirus, Antisense-Oligonukleotide

MDM2, alternative splicing, soft tissue sarcomas, prognosis, amplification, p14ARF, animal model, adenoviral vectors, antisense-oligonucleotides

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Inhaltsverzeichnis
Referat, Inhaltsverzeichnis, Abkürzungen
1 Einleitung (1-21)
2 Material (22-28)
3 Methoden (29-55)
4 Ergebnisse (56-103)
5 Diskussion (104-128)
6 Zusammenfassung (129-131)
7 Literatur (132-140)
8 Anhang