Stefan Gleiter

Zellspezifischer Gentransfer mittels Varianten des Hüllproteins VP1 des murinen Polyomavirus

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt an der Mathematisch-Naturwissenschaftlich-Technischen Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 06.06.2002

Abstract
Um ein Zelltyp-spezifisches Transduktionssystem basierend auf dem Hüllprotein VP1 des murinen Polyomavirus zu entwickeln, wurde verschiedene Fusionsproteine von VP1durch Insertionen in den HI-Loop hergestellt und untersucht.
Die Insertion der Dihydrofolat-Reduktase in den HI-Loop zeigte, daß VP1 solche Insertionen toleriert und an dieser Stelle Proteindomänen inseriert werden können.
Um Zelltyp-spezifische Antikörper auf der Oberfläche von VP1 zu präsentieren, wurde die IgG bindende Domäne aus Protein A in den HI-Loop inseriert. Der Einsatz dieses Fusionsproteins (VP1-Z), zusammen mit einem Zelltyp-spezifischen Antikörper (Herceptin) und DNA, führte zu einer funktionellen, Zelltyp-spezifischen Transduktion eukaryontischer Zellen.
Weiterhin wurde das Fusionsprotein VP1-E8C untersucht. Die Insertion von 8 Glutamat- und einem Cysteinrest in den HI-Loop erlaubte die kovalente Kopplung eines Fv-Fragmentes des Antikörpers B3 an diese VP1-Variante. Auch mit VP1-E8C konnte eine Zelltyp-spezifische Transduktion nachgwiesen werden.
Als limitierende Schritte beider VP1-basierten Transduktionssysteme konnte die Lokalisation im lysosomalen Kompartiment und bei VP1-E8C eine verringerte DNA Bindung nachgewiesen werden. Die Optimierung der Systeme hinsichtlich dieser limitierenden Schritte führte zu Transduktionsraten von 0,45% (VP1-Z) bzw. 0,1% (VP1-E8C).
Es konnte mit dieser Arbeit gezeigt werden, daß die Modifikation von VP1 zu einem spezifischen und effizienten Transduktionssystem führt.

To develop a transduction system on the basis of the coat protein VP1 of the murine polyomavirus several VP1 fusion proteins were created by insertions into the HI-loop and the variants were analysed. The insertion of dihydrofolate reductase in the HI-loop showed, that VP1 tolerates such modifications and protein domains can be inserted at this position.
In order to bind cell-type specific antibodies on the surface of VP1, the IgG binding domain of protein A was inserted in the HI-loop. The use of this fusion protein (VP1-Z), together with a cell-type specific antibody (Herceptin) and DNA, resulted in a functinell and cell-type specific transduction of eucaryotic cells.
In addition the fusion protein VP1-E8C was investigated. The insertion of 8 glutamic acid and one cystein residue in the HI-loop allowed the covalent coupling of the Fv-fragment of the antibody B3 on this VP1-variant. Also for VP1-E8C a cell-type specific transduction could be shown.
As limiting steps of the two VP1-based transduction system the lysosomal localisation and a reduced DNA binding ability for VP1-E8C could be determined. The optimisation of the transduction systems with respect to these limiting steps led to a transduction rate of 0.45% (VP1-Z) and 0.1% (VP1-E8C).
In this thesis it could be demonstrated that the modification of VP1 leads to a specific and efficent transduction system.

Keywords:
VP1, Gentransfer, Zelltyp-Spezifität, Fusionsprotein, Gentherapie

VP1, gene transfer, cell-type specificity, fusion protein, gene therapy

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Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
1 Zusammenfassung (1-3)
2 Einleitung (4-25)
3 Grundlagen und Ziele der Arbeit (26-29)
4 Ergebnisse (30-41)
5 Abkürzungen (42-43)
6 Literaturverzeichnis (44-60)
7 Veröffentlichungen (61-145)