Cornelia Dreßler

Interaktionen von Losartan und seinem Hauptmetaboliten EXP 3174 mit Membrantransportern in vitro, in situ und in vivo:
Affinitäts- und Transportparameter und ihre Abhängigkeit von experimentellen Bedingungen sowie von der Anwesenheit ausgewählter Inhibitoren

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt an der Mathematisch-Naturwissenschaftlich-Technischen Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 12.07.2002

Abstract
Losartan, die Leitsubstanz der nichtpeptidergen Angiotensin-II-Antagonisten, wird in vivo durch oxidative Biotransformation zu dem pharmakologisch aktiveren und länger wirksamen aktiven 5-Carbonsäuremetaboliten EXP 3174 biotransformiert und zeigt eine geringe Bioverfügbarkeit.
Vor einiger Zeit wurde bekannt, dass ein starker intestinaler Metabolismus zu einer geringen und variablen Bioverfügbarkeit beitragen kann. Aber nicht allein der Metabolismus, sondern auch die aktive Sekretion durch Transporter, wie z.B. durch den ABC-Transporter P-Glykoprotein (P-GP), sind ggf. maßgeblich für eine limitierte orale Bioverfügbarkeit von Arzneistoffen verantwortlich.
Mit den im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen konnte in Transportstudien an Caco-2-Zellmonolayern gezeigt werden, dass experimentelle Bedingungen in der Lage sind die Transportparameter zu modifizieren. Für die Angiotensin-II-Antagonisten konnte eine deutliche Richtungsabhängigkeit des Transportes gezeigt werden (Erhöhung der Sekretion im Vergleich zur Absorption), was auf einen Carrier-vemittelten sekretorischen Transport, wie z.B. durch P-GP, schließen ließ. Unter Einfluß des P-GP-Modulators Verapamil wurde ein Anstieg absorptiver Prozesse und eine Reduktion des Effluxtransportes von Losartan und EXP 3174 nachgewiesen.
Im Radioligandenbindungsassay wurde der direkte Nachweis erbracht, dass sowohl Losartan als auch EXP 3174 mit dem Effluxtransporter P-GP interagieren. Die mit dem Einbindungsstellen-Modell ermittelten IC50-Werte (Losartan: 1425 M; EXP 3174 2207 M) sind aber im Vergleich zur Modellsubstanz Talinolol (228 M) und Verapamil
(334 M) deutlich erhöht, was mit einer geringeren Affinität verbunden ist. Ebenso zeigten die Ergebnisse der Studien, dass auch Lösungsmittelzusätze und pH-Wertveränderungen in der Lage sind die Bindung an P-GP zu modifizieren.
In-situ-Rattendarmperfusionen wiesen nach, dass aktive Transporter die intestinale Permeabilität von Losartan und EXP 3174 beeinflussen (Losartan: MRP1, P-GP und EXP 3174: MRP1, P-GP und MCT1) und die Permeabilität tageszeitlichen Schwankungen unterliegt.
Das Distributionsverhalten der Angiotensin-II-Antagonisten in Ratten ergab als hauptsächlichen Verteilungsort die Leber gefolgt von Niere und Blut. Unter Einfluss von Verapamil konnte lediglich beim Losartan eine Erhöhung der Bioverfügbarkeit nachgewiesen werden, die Gewebeselektivität beider Substanzen wird durch Comedikation mit Verapamil jedoch nicht verändert und es konnte nur eine geringfügige Zunahme der AUCs gefunden werden.
Die pharmakokinetischen Untersuchungen an Ratten zur Ermittlung der Relevanz intestinaler und biliärer Sekretion durch Vergleich der kinetischen Parameter beider Substanzen ergaben, dass der geschwindigkeitsbestimmende Schritt in der EXP 3174-Kinetik die Absorption bzw. Rückabsorption ist.
In der Arbeit wurde gezeigt, dass jede verwendete Technik ihre Bedeutung in der Aufklärung von Mechanismen hat. Die Affinitätsstudien dienen dem Nachweis der Bindung an bestimmte Bindungsstellen und Struktur-Affinitäts-Untersuchungen. Transportstudien mit Zellmonolayern bzw. isolierten Gewebeschichten werden zur Vorhersage der Absorbierbarkeit von Arzneistoffen herangezogen und In-situ-Perfusionsstudien am Rattendarm können zur Testung von Arzneistoff-Arzneistoff-Interaktionen eingesetzt werden. Die derzeit vorliegenden Ergebnisse ergaben, dass die In-situ-Perfusionsstudien den besten prädiktiven Wert für die Vorhersage von Arzneistoff-Arzneistoff-Interaktionen auf Absorptionsebene besitzen.

Losartan, the prototype of a new class of nonpeptide angiotensin II antagonists, is metabolized by oxidative degradation in vivo to the pharmacologically more active active and longer effective 5-carboxylic acid metabolite EXP 3174 and is showing a low bioavailability.
Recently it was recognized that a pronounced intestinal metabolism may contribute to a low and variable bioavailability. Not only metabolism, but also active secretion by ATP-binding cassette (ABC) transporters, such as P-glycoprotein (P-GP), has been identified as an important factor of oral drug bioavailability.
Transport experiments with Caco-2 cell monolayer showed that experimental conditions can modify transport parameters. Furthermore a direction-dependent transport was detected for the angiotensin II antagonists (increase of secretion in comparison to the absorption), this suggests a carrier-mediated secretory transport, for example like P-GP. The P-GP modulator verapamil an increase of absorptive processes and a reduction of the efflux transport of losartan and EXP 3174 was detected.
Radioligand binding studies showed, that losartan as well as EXP 3174 interact with the efflux transporter P-GP. Based on the one-site-binding model, the calculated IC50-values (losartan: 1425 M; EXP 3174: 2207 M) are higher compared to the model compounds talinolol (228 M) and verapamil (334 M) and indicating a smaller affinity to P-GP. The results of the binding studies also detected, that solvent addition and pH-variations modified the binding to P-GP.
In-situ intestinal perfusions in rats proved, that active transporters influence the intestinal permeability of losartan and EXP 3174 (losartan: MRP1, P-GP and EXP 3174: MRP1, P-GP and MCT1) and the permeability exhibited ciracadian variations.
The determination of the relevance of intestinal as well as biliary secretion (based on comparison of the kinetic key parameter) for both drugs in pharmacokinetic studies with rats showed, that in the kinetic of EXP 3174 the absorption/backabsorption is the rate-limiting step.
The distribution behaviour/characteristics of the angiotensin II antagonists in rats yielded that the highest concentrations were found in liver, kidney and blood. With coadministration of verapamil only for losartan an elevation of bioavailabiliy was detected, the tissue-selectivity of both compounds is not influenced by verapamil and a negligible increase was found.
The investigations show that each of the used techniques is important in clearing up mechanisms. Affinity studies were used to predict the binding characteristics of drugs as well as for structure-affinity-studies. Transport experiments with cell monolayer or isolated tissuelayer are useful in the prediction of drug absorption and in-situ intestinal perfusion studies are a good tool in clearing up drug-drug-interactions. The results show that in-situ perfusion studies have the highest value in the predicting drug-drug interactions for absorption processes.

Keywords:
Losartan, Absorption, Interaktionen, Arzneistoffmetabolismus, Membrantransporter, Multidrug resistance, P-Glykoprotein, Caco-2-Zellen, Pharmakokinetik

Losartan, Absorption, Interactions, Drug metabolism, Membrane transporter, Multidrug resistance, P-Glycoprotein, Caco-2-Cells, Pharmacokinetics

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Inhaltsverzeichnis
Inhalts-, Abbildungs-, Tabellenverzeichnis, Abkürzungen (I-X)
1. Einleitung (1-24)
2. Problemstellung (25-26)
3. Ergebnisse (27-54)
4. Diskussion (55-61)
5. Materialien und Methoden (62-88)
6. Zusammenfassung (89-90)
7. Literaturverzeichnis (91-103)
Anhang (XI-LXXIX)
Präsentationen