Johann Joachim Framm

Klonierung und Expression in E. coli der Cardenolid-16'-O-Glucohydrolase von Digitalis lanata EHRH.

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt an der Mathematisch-Naturwissenschaftlich-Technischen Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 18.04.2002

Abstract
Cardenolide werden aufgrund der Struktur ihrer Zuckerkette in Primär- und Sekundärglykoside eingeteilt. Während Primärglykoside am Ende der Zuckerkette eine -Glucose aufweisen, fehlt Sekundärglykosiden diese -Glucose. Die Abspaltung der terminalen Glucose ist eine enzymatisch katalysierte Reaktion. Bisher konnten aus Blättern von Digitalis lanata Ehrh. 2 Glykosyl-Hydolasen gereinigt und charakterisiert werden, die ein unterschiedliches Substratspektrum aufweisen. Die Cardenolid-16'-O-Glucohydrolase (CGH I) katalysiert die Hydrolyse von Primärglykosiden mit einem Tetrasaccharid, die Cardenolid-4'-O-Glucohydrolase (CGH II) von Primärglykosiden mit einem Disaccharid in der Zuckerkette.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde mit Hilfe von Peptidsequenzen der CGH I ein cDNA-Klon aus Blättern von D. lanata isoliert, der für eine -Glucosidase aus der Familie 1 der Glykosyl-Hydrolasen kodiert. Die abgeleitete Aminosäuresequenz wies zu den Peptidsequenzen der CGH I Abweichungen auf. Die cDNA wurde funktionell in E. coli exprimiert und einige Eigenschaften des rekombinanten Enzyms bestimmt. Aufgrund der Übereinstimmung des rekombinanten Enzyms mit der gereinigten CGH I wurde die cDNA als cgh I bezeichnet und für die CGH I in D. lanata Isoenzyme postuliert.
Eine gewebsspezifische mRNA-Expression der cgh I in D. lanata konnte gezeigt werden, wobei die stärksten Signale in Keimlingen, einjährigen Blättern und Früchten, schwächere in zweijährigen Blättern und Blüten zu finden waren. Die Signale korrelierten mit dem Gehalt des jeweiligen Gewebes an Cardenoliden.
Die Aminosäuresequenz der cgh I wies im Vergleich zu anderen -Glucosidasen einige strukturelle Besonderheiten auf. Mutanten der cgh I, in denen diese Aminosäuren deletiert oder punktmutiert waren, wurden in E. coli exprimiert. Für keine dieser Mutanten konnte eine glykosidspaltende Aktivität nachgewiesen werden, was auf eine Funktion dieser Aminosäuren bei der Proteinfaltung, Substraterkennung oder Enzymkatalyse hinweisen könnte.

Based on the structure of their sugar chain cardenolides can be divided in primary and secondary glycosides. The sugar chain of primary glycosides is terminated by glucose whilst secondary glycosides lack a glucose residue. Cleavage of the glucose is an enzymatic reaction. Up to now 2 different glycosyl hydrolases from leaves of Digitalis lanata Ehrh. have been purified and characterized. Cardenolid-16'-O-Glucohydrolase (CGH I) hydrolyses primary tetraglycosides. Cardenolid-4'-O-Glucohydrolase (CGH II) is specific for primary diglycosides.
In the present work, isolation of a cDNA clone for a -glucohydrolase from leaves of D. lanata is reported. The sequence could be identified as a member of family 1 of glucosyl hydrolases. It matched most but not all peptides of purified CGH I. The cDNA was expressed in E. coli and some features of the recombinant enzyme were determined. Results were similar to purified CGH I. Thus, the cDNA was named cgh I and isoenzymes for CGH I in D. lanata were postulated.
cgh I showed a spatial mRNA expression. Signals could be detected in leaves, flowers, stems and fruits. The level of cgh I hybridising mRNA correlates with the cardenolide content of the different organs.
The sequence of cgh I revealed some features that had not been found in other glycosyl hydrolases. Mutants of cgh I in which amino acids were either deleted or mutated were expressed in E.coli. None of them showed enzymatic activity for the deglucosylation of primary glycosides. Therefore these amino acids might play a role in protein folding, substrate recognition or enzyme catalysis.

Keywords:
Cardenolide, Primär- und Sekundärglykoside, Digitalis lanata Ehrh., Glykosyl-Hydrolasen, Cardenolid-16'-O-Glucohydrolase, CGH I, Isoenzyme

Cardenolides, primary- and secondary glycosides, Digitalis lanata Ehrh., glycosyl hydrolases, Cardenolid-16'-O-Glucohydrolase, CGH I, isoenzymes

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Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis, Abkürzungsverzeichnis
A Einleitung und Problemstellung (1-8)
B Material und Methoden (9-43)
C Ergebnisse (44-59)
D Diskussion (60-86)
E Zusammenfassung (87-89)
F Literaturverzeichnis (90-98)