Ezequiel Franco Lara

Framework for online modeling, optimization and monitoring of bioprocesses

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades Doktor-Ingenieur (Dr.-Ing.) vorgelegt an der Mathematisch-Naturwissenschaftlich-Technischen Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 15.10.2002

Abstract
Im Folgenden wird die Festlegung eines Bezugssystems und der Rahmenbedingungen für die online Modellierung, Beobachtung und Optimierung von Bioprozessen dargestellt. Die Modellierungs- und Beobachtungsschemata beinhalteten eine auf hybriden Modellen basierende mathematische Formulierung des mikrobiellen Systems. Unter dem Begriff "hybride Modelle" versteht man die Zusammenstellung einer Reihe von nicht-linearen Differentialgleichungen und verschiedener "black-box" Modelle. Während die Kinetik bzw. die spezifischen Wachstums- und Produktionsraten mit Hilfe künstlicher neuronaler Netze oder neuro-fuzzy Ansätzen dargestellt wurden, beschrieben die Differentialgleichungen die Massenbilanzen des Bioreaktors. Unter batch bzw. fed-batch Bedingungen wurden 3 verschiedene Mikroorganismenstämme kultiviert; 2 davon waren rekombinante Escherichia coli-Stämme. Zur Validierung der Ergebnisse wurde ein rekombinanter Stamm der Hefe Kluyveromyces lactis eingesetzt. In der Arbeit werden die off-line Modellierung und Optimierung der Produktion des viralen Hüllproteinskomplex VP1-DHFR durch einen rekombinanten Escherichia coli BL21 Stamm präsentiert. Zur Optimierung der Prozessführung wurde eine evolutionäre Methodik genutzt: ein Modell wurde unter Verwendung des verfügbaren Wissens und vorhandener Datensätze aktualisiert; dieses aktualisierte Modell wurde zur Optimierung des Prozesses eingesetzt; dann erfolgte ein Kontrollexperiment, um die Richtigkeit der Modellannahmen zu bestätigen bzw. um Daten zur weiteren Verbesserung des Modells zu gewinnen. Die letzten Teile dieser Arbeit sind der online-Anwendung der verschiedenen Techniken zur Modellierung, Beobachtung und Optimierung gewidmet. Bei der Produktion der Protein VP1-DHFR wurde eine neuro-fuzzy Modellierung angewendet, die auf wechselnde Bedingungen reagieren kann, so dass im Vergleich zu klassischen Optimierungsansätzen, höhere Produktivitäten erzielt werden konnten. Probleme wie die langsame Konvergenz des Identifizierungsverfahrens, die beim off-line-Training künstlicher neuronaler Netze auftreten, werden durch das online Training von hybriden Modellen deutlich vermindert. Am Beispiel der Produktion des rekombinanten Proteinkomplexes GAL80/HIS-TAG durch die Hefe Kluyveromyces lactis, wurde ein soft-Sensor vorgestellt, der die Echtzeitschätzung und die Beobachtung von Profitfunktionen bzw. die Beurteilung der Leistung eines Prozesses erlaubte. Gezeigt wurde auch die inhärente Plastizität eines neuronalen Netzes, die die komplexe Kinetik eines Prozesses nur auf der Basis online gemessener prozesskorrelierter Variablen charakterisiert. Mit Hilfe hybrider Modelle kann das vorgestellte Bezugssystem selbst komplexe Prozesse in einer geringen Anzahl von Optimierungsschritten verbessern. Die Methodik kann dazu verwendet werden, schnell und kostengünstig, d. h. mit geringem experimentellen Aufwand, die optimale Führung bei der Prozessentwicklung zu erzielen oder laufende Produktionsprozesse zu optimieren.

The establishment of a framework for the online modeling, monitoring and optimization of bioprocesses is presented. The modeling and monitoring schemas comprise a mathematical formulation of the microbial system through neural network-based hybrid models. Under the concept of hybrid model is understood a set of non linear differential equations and neural network or neuro-fuzzy models, which are incorporated to account exclusively for key kinetic parameters, as the specific growth or specific production rate. The set of differential equations describes the mass balance relationships of the biotechnical process. Three different microbial cultivations were carried out, two of them comprising recombinant strains of the bacteria Escherichia coli and another a recombinant strain of the yeast Kluyveromyces lactis. The methodology is first exemplified with the off-line modeling and optimization of the production of the viral capsid complex VP1-DHFR using a strain of Escherichia coli BL21 under fed-batch conditions. The optimization task is fulfilled using an evolutionary procedure: first actualization of a model based on available information and a priori knowledge; the actualized approach was used in a model-based optimization; a control experiment is performed to test the correctness of the model's assumptions, supplying additional data for model's improvement. It is demonstrated how this technique enables the estimation of key unmeasured variables for the process, like the specific growth rate. This formulation not only improves the description and understanding of the biological system, but also allows a model-based optimization of the operating conditions of the cultivation. The last part of the work is dedicated to the online implementation of the aforementioned modeling, monitoring and optimization techniques. In the production of VP1-DHFR, it is proved how this method can effectively deal with changing environments and that increased productivities were obtainable, as compared to optimizations employing conventional approaches. Online training of hybrid models confirmed its ability to circumvent slow convergence problems caused by the training phase. Finally, validated at the optimized production of recombinant protein complex GAL80/HIS-TAG with Kluyveromyces lactis, the real-time estimation and monitoring of bioprocesses' profits through a soft-sensor is presented. The approach demonstrates the inherent plasticity of the neural network-based approach to infer complex kinetic rates, using exclusively control variables like temperature and process correlated measurements available online. Being the reduction of the invested time for developing and improving a given process a fundamental demand in today's biotechnology, the developed online framework improved the gain of process knowledge at high learning rates. Such a methodology can be viewed either as an alternative or as an intermediary evolution step between pure empirical towards full formal mechanistic approaches.

Keywords:
hybride Modelle, Optimierung, Beobachtung, neuronale Netze, Fuzzy, virales Hüllprotein VP1

Hybrid models, optimization, monitoring, neural networks, fuzzy, viral capsid VP1

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Inhaltsverzeichnis
Content
Summary, Zusammenfassung (II-III)
1 Introduction (1-7)
2 Materials and methods (8-13)
3 Hybrid modeling of a multi-substrate fermentation (14-26)
4 Hybrid model-based optimization of the production of the viral capsid fusion protein VP1-DHFR (27-44)
5 Online modeling and optimization of the production of the viral capsid protein VP1-DHFR using a neuro-fuzzy approach (45-61)
6 Online monitoring of performance indexes employing a neural network-based soft-sensor (62-74)
7 General conclusions (75-77)
Appendix (78-91)
Publications List (93)