Petra ten Hoopen

Immunomodulation of jasmonate functions

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt an der Mathematisch-Naturwissenschaftlich-Technischen Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 28.11.2002

Abstract
Jasmonate sind eine Gruppe von Signalmolekülen die Pflanzenzellen nutzen, um Antworten auf feindliche Umweltbedingungen zu vermitteln und bestimmte Entwicklungsprozesse zu steuern.
In der vorliegenden Arbeit wurde die molekulare Technik der Immunmodulation genutzt, um die Wirkmechanismen von Jasmonaten zu untersuchen. Rekombinante single-chain Fv-Antikörper wurden durch Bindung an natürlich vorkommende (3R, 7R)-Jasmonsäure und an deren biosynthetische Vorstufe (9S, 13S)-12-oxo-10, 15(Z)-Phytodiensäure, selektiert. Gene, die diese rekombinanten Antikörper kodieren, wurden in pflanzliche Expressionsvektoren zur ubiquitären Produktion der Antikörper in verschiedenen Kompartimenten der Zellen kloniert. Transgene Nicotiana tabacum-Pflanzen, die durch Agrobacterium-vermittelten Gentransfer erzeugt wurden, akkumulierten stabile und vererbbare rekombinante anti-Jasmonat Antikörper im Zytosol, im ER, im Stroma und der äußeren Membran der Chloroplasten. Die Antikörper binden spezifisch die gemeinsame Struktur aller Jasmonate, die essentiell für ihre physiologische Aktivität ist.
Mechanische Verletzung ist ein abiotischer Reiz, bei dessen Vermittlung Jasmonate als Siganlmolekül eine Schlüsselrolle spielen sollen. Daher wurden verletzte Blätter von transgenen und Wildtyp-Tabakpflanzen unter besonderer Berücksichtigung ihres intrazellulären Gehaltes an mehrfach ungesättigten Fettsäuren, der endogenen Level saurer Phytohormone und ihrer Genexpressionsprofile untersucht.
Die Immunmodulation der Jasmonatfunktionen ist spezifisch für Zellkompartimente. Befunde aus der Analyse der transgenen Pflanzen zeigen, daß die anti-Jasmonat scFv-Antikörper einen künstlichen "sink" für Jasmonäure im ER bilden. Allerdings scheint der vermutliche Wirkort der Jasmonsäure im Zytosol der Zelle zu liegen. Ein bisher unbekannter Kontrollmechanismus, der die Zunahme endogener Jasmonate nach mechanischer Verwundung von Pflanzen steuert, könnte durch die ektopische Expression von anti-Jasmonat scFv-Antikörpern im Zytosol, im ER und im Stroma der Chloroplasten gestört werden.

Jasmonates are a group of signalling molecules which plant cells use to mediate responses to adverse environmental conditions and to regulate distinct stages of plant development.
In this study a molecular technique of immunomodulation has been adopted to investigate the mechanisms by which jasmonates operate. Genes coding for recombinant single-chain Fv antibodies, selected against the naturally occurring (3R, 7R)-jasmonic acid and against its biosynthetic precursor - (9S,13S)-12-oxo-10,15(Z)-phytodienoic acid, were cloned into plant expression vectors for production of the antibodies in all plant organs but different cell compartments. Transgenic Nicotiana tabacum plants, that were generated by Agrobacterium-mediated gene transfer, accumulated stable and heritable anti-jasmonate recombinant antibodies in their cytosol, in the endoplasmic reticulum, in the stroma and outer membrane of chloroplasts. The antibodies bind specifically the common structure of all jasmonates that is essential for the physiological activity.
Mechanical wounding is an abiotic stimulus, where jasmonates are assumed to be a key signalling molecule mediating response to this damage. Therefore, wounded leaves of transgenic and wild-type tobacco plants were investigated in special regard to their intracellular content of polyunsaturated fatty acids, endogenous levels of acidic phytohormones and gene expression profile.
The immunomodulation of jasmonate functions is cell-compartment specific. Results of this study indicate that the place of putative jasmonic acid function seems to be in the cytosol of the cell. Moreover, a so far unknown control mechanism regulating the increase in endogenous jasmonate levels upon wounding seems to be disturbed by the expression of the anti-jasmonate single-chain Fv antibodies in the cytosol, ER and stroma of chloroplasts.

Keywords:
Jasmonsäure, 12-oxo-Phytodiensäure, single-chain Fv-Antikörper, Immunmodulation, Transgene Nicotiana tabacum-Pflanzen, Genexpressionsprofile

Jasmonic acid, 12-oxo-phytodienoic acid, single-chain Fv-antibody, immunomodulation, transgenic Nicotiana tabacum plants, gene expression profile

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Inhaltsverzeichnis
List of abbreviations, Contents
1 Plant defence mechanisms (1-15)
2 Recombinant antibodies in prokaryotic and eukaryotic cells (16-25)
3 Introduction of scFv antibody fragments into the plant genome (26-37)
4 Selection and characterization of transgenic plants (38-46)
5 Analysis of wound stress response in transgenic plants with anti-jasmonate scFv antibodies (47-66)
6 Discussion (67-78)
7 Material and methods (79-89)
Summary, Zusammenfassung, Shrnutí (90-94)
References (95-106)