Sylvia Franke

Das Kupfer-transportierende CusCFBA-Efflux-System aus Escherichia coli

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt an der Mathematisch-Naturwissenschaftlich-Technischen Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 17.12.2002

Abstract
Die cus-Determinante von Escherichia coli ist eines von drei chromosomal kodierten Systemen, die an der Kupferhomöostase beteiligt sind. Das cusCFBA-Operon kodiert für die Proteine CusCBA, die eine Entgiftung von Kupfer und Silber wahrscheinlich durch Efflux vermitteln, sowie ein neuartiges Protein CusF. Es konnte gezeigt werden, dass cusB und cusA essentiell, für die cus-vermittelte Kupferresistenz sind. Für die Vermittlung der vollen Kupferresistenz ist aber auch das Vorhandensein von cusC und cusF notwendig.
Bei CusA handelt es sich um das zentrale Transportprotein des CusCBA-Efflux-Komplexes. Über Aminosäureaustausch-Mutationen konnten periplasmatisch lokalisierte Methioninreste, M573, M623 und M672, identifiziert werden, die als mögliche Substratbindestellen wichtig für die cus-vermittelte Kupferresistenz sind. Weitere Methioninreste hatten keinen Einfluss auf die Kupferresistenz. Es konnte gezeigt werden, dass das Vorhandensein geladener Aminosäurereste in der Transmembran-Helix IV von CusA wichtig für die Funktion des Proteins ist.
Das neuartige Protein CusF ist periplasmatisch lokalisiert. Unter Verwendung CusF-spezifischer polyklonaler Antikörper konnte CusF im periplasmatischen Extrakt von Escherichia coli nach Inkubation mit Cu2+ nachgewiesen werden. Das gereinigte CusF-Protein band in vitro ein mol Kupfer pro mol Protein. CusF wies nach Kupferbindung eine pink-violette Färbung auf und zeigte im UV/vis-Spektrum ein Maximum bei ca. 510 nm. Über Aminosäureaustausch-Mutationen konnte gezeigt werden, dass die Methioninreste M69 und M71 wichtig für die Kupferbindung und somit für die Funktion von CusF sind. Weitere Aminosäurereste, als potentielle Liganden des Kupfers, hatten keinen Einfluss. Unter Verwendung des Yeast-Two-Hybrid-Systems konnte eine Interaktion von CusF mit den Proteinen CusC und CusB des CusCBA-Efflux-Komplexes nachgewiesen werden.

The cus-determinant of Escherichia coli is one of the three chromosomal encoded systems involved in copper homeostasis. CusCBA, encoded by the cusCFBA-operon, detoxify copper and silver probably by efflux. CusF is a novel protein. It could be shown that cusB and cusA were essential for copper resistance but cusC and cusF were only required for full resistance.
CusA is the transport-protein of the CusCBA-efflux complex. Results from site-directed mutagenesis of methionine residues M573, M623 and M672, located in the periplasmic domains of CusA, suggested a role in substrate binding. Several other methionine residues of CusA were not important. It could be shown that charged amino acid residues located in the membrane helix IV were also necessary for function of CusA.
The novel CusF protein was located in the periplasm. CusF could be found into the periplasmic fraction of E. coli after incubation with copper. Purified CusF bound one mol copper per mol protein. The pink CusF copper protein complex exhibited an absorption maximum in the UV/vis spectrum of around 510 nm. Methionine residues, M69 and M71, were involved in copper binding and necessary for function of CusF as shown by site-directed mutagenesis. Other amino acid residues were not essential. CusF interacted with CusB and CusC polypeptides in a yeast two-hybrid assay.

Keywords:
Escherichia coli, cus, Schwermetallresistenz, Protein-Reinigung, Kupfer-Bindung, Aminosäureaustausch-Mutationen, Hefe-Zwei-Hybrid-System, neuartiges Protein

Escherichia coli, cus, heavy metal resistance, protein purification, copper binding, site-directed mutagenesis, yeast two hybrid system, novel protein

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Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis, Abkürzungsverzeichnis (I-VII)
1. Einleitung (1-4)
2. Material und Methoden (5-50)
3. Ergebnisse (51-89)
4. Diskussion (90-112)
5. Zusammenfassung (113-114)
6. Literatur (115-129)