Nina Großer

Endothelprotektion durch Acetylsalicylsäure: Stickstoffmonoxid und cGMP als antioxidative Mediatoren

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt an der Mathematisch-Naturwissenschaftlich-Technischen Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 27.09.2002

Abstract
In der vorliegenden Arbeit wird die Rolle von Stickstoffmonoxid (NO) und cGMP bei der Vermittlung endothelprotektiver und antioxidativer Effekte von Acetylsalicylsäure (ASS) untersucht. Eine 24-stündige Inkubation mit Wasserstoffperoxid führt zu einer deutlichen Schädigung kultivierter Endothelzellen. ASS wirkt in Endothelzellen nach mehrstündiger Inkubation (> 6 Stunden) protektiv gegenüber Wasserstoffperoxid-induzierter Toxizität und erhöht die Viabilität der Zellen konzentrationsabhängig. Experimente mit dem NO-Radikalfänger PTIO (30 然) und dem NO-Synthase-Inhibitor L-NMMA (25 然) belegen, dass der L-Arginin-NO-Stoffwechselweg kausal zur endothelprotektiven Wirkung von ASS beiträgt. Die inhibitorische Wirkung des sGC-Blockers ODQ (1 然) auf die ASS-abhängige Cytoprotektion sowie der protektive Effekt membrangängiger cGMP-Derivate sprechen für eine Mediatorfunktion des sGC/cGMP-Systems. Die signaltransduzierende Bedeutung des NO-Botenstoffs cGMP wird auch durch den Befund eines intrazellulären cGMP-Anstiegs nach Gabe von ASS und dessen Potenzierung durch den direkten sGC-Aktivator YC-1 (10 -30 然) unterstützt. Die ASS-vermittelte cGMP-Akkumulation ist wie die Endothelprotektion durch PTIO bzw. L-NMMA hemmbar und damit NO-abhängig. ASS führt zu einer Steigerung der endothelialen NO-Synthese, ohne die Expression der endothelialen NO-Synthase zu beeinflussen. Die Stimulation NO/cGMP-abhängiger Signalwege durch ASS lässt sich also mit einem direkten Effekt auf die Aktivität der NO-Synthase erklären. Andere COX-Hemmer (z. B. Diclofenac, Indometacin) sind unter den gewählten Bedingungen ohne Einfluss auf den NO/cGMP-Signalweg und die endotheliale Resistenz gegenüber oxidativem Stress. Dieser Befund spricht gegen eine ursächliche Beteiligung COX- bzw. Prostaglandin-abhängiger Mechanismen an den beschriebenen ASS-Effekten. Die Ergebnisse dokumentieren, dass ASS über eine Aktivierung der L-Arginin/NO/cGMP-Kaskade endothelprotektive Effekte induziert. Dieser neuartige antioxidative Wirkmechanismus von ASS könnte klinisch zur Prävention atherosklerotischer Prozesse und der endothelialen Dysfunktion beitragen.

The present study investigates the involvement of nitric oxide (NO) and cyclic GMP (cGMP) in antioxidant cellular protection induced by aspirin. A 24-h incubation with hydrogen peroxide markedly reduced viability of cultured endothelial cells. Preincubation with aspirin (3-30 痠ol/L) protected endothelial cells from hydrogen peroxide-mediated toxicity and increased viability in a concentration-dependent fashion by up to 95% of control. This effect was specific in that other nonsteroidal anti-inflammatory drugs, such as salicylate or indomethacin, did not alter hydrogen peroxide toxicity. Aspirin-induced endothelial protection was abrogated in the presence of the NO scavenger PTIO (30 痠ol/L) and the inhibitor of soluble guanylyl cyclase ODQ (1 然). Moreover, the L-arginine antagonist L-NMMA (25 痠ol/L), but not its D-enantiomer, led to complete inhibition of aspirin-dependent cytoprotection. In agreement with this, aspirin enhanced NO synthase activity (citrulline formation) and intracellular cGMP accumulation in endothelial cells. Protein expression of endothelial NO synthase remained unaffected in the presence of aspirin. Aspirin had no effect on cGMP levels in RFL-6 cells that are devoid of NO synthase activity but rich in soluble guanylyl cyclase. Moreover, cGMP increases by both aspirin or exogenous nitric oxide were synergistically enhanced in the presence of YC-1, an NO-independent activator of soluble guanylyl cyclase. These observations corroborate the involvement of nitric oxide in aspirin-dependent cGMP stimulation. Our data demonstrate that endothelial NO synthase is a site of action of aspirin and that the NO/cGMP system assumes a crucial function in mediating the cytoprotective action of aspirin.

Keywords:
Acetylsalicylsäure, Stickstoffmonoxid, Stickstoffmonoxid-Synthase, cGMP, Endothel, oxidativer Stress, Atherosklerose, Cytoprotektion, antioxidative Schutzmechanismen, Zellkultur

aspirin, nitric oxide, nitric oxide synthase, cyclic GMP, endothelium, oxidant stress, atherosclerosis, cytoprotection, antioxidant defense mechanism, cell culture

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Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis, Abkürzungsverzeichnis (1-4)
1 Einleitung und Problemstellung (5-15)
2 Problemstellung (16-17)
3 Methoden und Material (18-26)
4 Ergebnisse und (27-58)
5 Diskussion (59-66)
6 Zusammenfassung (67)
7 Literaturverzeichnis (68-89)
8 Veröffentlichungen (90-91)