Birgit Gruner

ACBP-Isoformen in Digitalis lanata EHRH.

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt an der Mathematisch-Naturwissenschaftlich-Technischen Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 11.02.2003

Abstract
Bei der hier untersuchten Proteinfamilie der ACBPs handelt es sich um multifunktionelle Proteine, deren Involvierung in sowohl grundlegende Zellstoffwechselvorgänge wie Steroidsynthese und Fettsäurestoffwechsel, als auch hochspezialisierte und streng regulierte Prozesse wie Insulin- und Cholecystokininsekretion im menschlichen und tierischen System untersucht wurden.
Am besten etabliert ist jedoch ihre Funktion als Acyl-CoA bindende Proteine (ACBPs), kleine cytosolische Proteine, die im gesamten Tier- und Pflanzenreich sowie in eukaryotischer Hefe nachgewiesen werden konnten. Durch ihre hochspezifische Bindung von langkettigen Fettsäure-Coenzym A-Thioestern übernehmen sie eine Poolbildner- und Transporterfunktion für diese Liganden. Da Acyl-CoA-Ester nicht nur Zwischenprodukte in Fettsäureabbau und -synthese darstellen, sondern auch als regulatorische Signalmoleküle in Genexpression und Zellstoffwechsel eingreifen, stellen ihre Bindungsproteine, die ACBPs, ein wichtiges Bindeglied für die Regulation verschiedenster Stoffwechselvorgänge dar.
Diese Acyl-CoA-bindenden Proteine sollten nun in Digitalis lanata untersucht werden, um nähere Einsicht in Organisation und Funktion dieser Proteinfamilie im pflanzlichen System zu gewinnen.
Es konnten dabei zwei vollständige cDNA-Sequenzen identifiziert werden (acbp3 und acbp4), welche eine ausgesprochen hohe Homologie sowohl untereinander als auch zu ACBPs anderer Spezies aufwiesen. Eine Expressionsanalyse bestätigte die Expression der entsprechenden Transkripte in allen untersuchten Pflanzenteilen von Digitalis lanata, wobei eine gewebespezifische Expression einzelner Isoformen diskutiert wurde. Es konnte dabei keine streßbedingte Regulation der Expression aufgezeigt werden. Eine genomische Southern-Analyse wies auf das Vorhandensein von mindestens 3, wahrscheinlich jedoch mehr ACBP-homologen Sequenzen im Genom hin. Die überexprimierten korrespondierenden Proteine der beiden cDNA-Sequenzen (ACBP3 und ACBP4) erwiesen sich als funktionell und wurden nach ihrer Aufreinigung qualitativen und quantitativen Bindungstests unterzogen. Durch gerichtete Mutagenese wurden sukzessive zwei Aminosäurepositionen (AS19 und AS23) der einen Isoform gegen die der jeweils anderen Isoform ausgetauscht. In einem neuentwickelten Bindungstest konnten hierbei geringfügige, jedoch signifikante Unterschiede im Bindungsverhalten von Wildtypen und Mutanten aufgezeigt werden. So bevorzugte ACBP3 ungesättigte und ACBP4 gesättigte Liganden, wobei die Doppelmutation in den Positionen 19 und 23 diese Tendenzen jeweils umkehrte. Dies suggerierte eine Involvierung dieser Aminosäurepositionen in Ligandenerkennung und Bindungsspezifität.

The ACBP family proved to be a multi-functional protein family which is not only involved in basic cell metabolism such as steroidogenesis and fatty acid metabolism but also in highly specialised and regulated processes such as insulin and cholecystokinin secretion. Such effects were so far mainly investigated within the human/animal system.
The best-established function of this family is that of an Acyl-CoA binding protein (ACBP), a small cytosolic protein that can be found throughout the whole eucaryotic kingdom as well as in eucaryotic yeast. Through their highly specific binding of long-chain fatty acid-coenzyme A-esters they act as pool former and transporter for these ligands. Acyl-CoA-esters are not only intermediates of fatty acid synthesis and consumption but also regulators and signalling molecules in gene expression and cell metabolism. Their binding partners, the ACBPs, are therefore important regulatory proteins for such functions.
In this work, the family of Acyl-CoA-binding proteins was investigated in Digitalis lanata to gain more insight into organisation and function of this protein family within the plant kingdom.
A cDNA bank screening resulted in the isolation of two complete cDNA sequences (acbp3 and acbp4) with very high homologies to each other as well as to ACBPs from other species. Expression analysis confirmed the expression of the respective transcripts in all Digitalis lanata tissues and organs investigated with a possible tissue specific expression of different isoforms discussed. The expression did not seem to be stress-related. The genomic Southern analysis suggested the existence of at least 3, possibly more, ACBP-homologous sequences within the genome. The overexpression and purification of the corresponding proteins (ACBP3 and ACBP4) resulted in fully functional recombinant proteins, which were tested in different binding assays. The influence of certain amino acid residues on ligand binding was investigated through site-directed mutagenesis. The amino acids in position 19 and 23 of the one isoform were switched for the amino acids of the respective other isoform. The binding specificity of the so obtained wild types and mutants was tested in a newly established binding assay which confirmed small but significant differences between the dissociation constants of the altered proteins. ACBP3 was shown to prefer unsaturated over saturated ligands while ACBP4 preferred saturated ligands. The double mutation in position 19 and 23 reversed these tendencies significantly towards the behaviour of the respective other wild type protein, which suggested an involvement of these amino acids in ligand recognition and binding affinity.

Keywords:
Acyl-CoA-bindendes Protein (ACBP), Acyl-CoA, Digitalis lanata, cDNA, Northern, Southern, Überexpression, Bindungstest, Gerichtete Mutagenese, Dissoziationskonstanten

Acyl-CoA binding protein (ACBP), Acyl-CoA, Digitalis lanata, cDNA, Northern analysis, Southern analysis, overexpression, binding assay, site-directed mutagenesis, dissociation constants

Online-Dokument im PDF-Format (7.415 KB) mit integrierter Gliederung.

Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis, Abkürzungen, Materialien und Geräte (I-XI)
A. Einleitung (1-23)
B. Methoden (24-54)
C. Ergebnisse (55-88)
D. Diskussion (89-110)
E. Zusammenfassung (111-113)
F. Literatur (114-124)
G. Anhang (125-135)