Frank Erdmann

Identifizierung und biochemische Charakterisierung neuer Calcineurin-Inhibitoren

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt an der Mathematisch-Naturwissenschaftlich-Technischen Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 26.02.2003

Abstract
Die Zahl der Krankheitsfälle, bei denen pathologische Veränderungen des Immunsystems, wie z.B. Allergien oder Autoimmunerkrankungen diagnostiziert werden, steigt stetig an. Ein weiterer Aspekt stellt die graft versus host-Reaktion dar, bei der ein Empfänger-Organismus auf ein transplantiertes Organ mit einer heftigen und meist lebensbedrohlichen Abstoßungsreaktion reagiert. Aus diesem Grund ist es notwendig, diese Immunantwort zu modulieren und somit eine Suppression des Immunsystems zu erreichen. Seit den 80er Jahren des letzten Jahrhunderts wird der Naturstoff Cyclosporin A (CsA) und später auch Tacrolimus (FK506) klinisch eingesetzt, um Transplantat-Abstoßungsreaktionen erfolgreich zu verhindern. Jedoch treten bei einer Langzeitmedikation zahlreiche schwere Nebenwirkungen auf. Deshalb wurden in den letzten Jahren intensive Anstrengungen unternommen, neue Leitstrukturen für Immunsuppressiva - insbesondere Calcineurin-Inhibitoren - zu definieren. Die Proteinphosphatase Calcineurin (CaN) stellt ein Schlüsselenzym der Immunantwort dar und wird durch CsA im Komplex mit der zytosolischen Peptidyl-Prolyl-cis/trans-Isomerase (PPIase) Cyclophilin gehemmt. In unserer Arbeitsgruppe wurden 2000 Verbindungen einer Substanz-Bank auf eine mögliche CaN-Inhibition untersucht. Dabei wurde der Naturstoff Gossypol als eine CaN-inhibierende Substanz identifiziert und wurde im Rahmen der Arbeit enzymkinetisch und zellbiochemisch charakterisiert. Obwohl für Gossypol zahlreiche Interaktionen mit anderen zellulären Proteinen nachgewiesen wurden, stellt diese Substanz eine neue Leitstruktur für die Entwicklung von monospezifischen CaN-Inhibitoren dar. Neben der Substanzbank standen unserer Arbeitsgruppe auch eine Vielzahl von Cyclosporin-Derivaten zur Verfügung. Nach Vorversuchen wurden die Substanzen CsA, [DAT-Sar]3CsA, [AD-Ser]8CsA und [Ac-MeBmt]1CsH ausgewählt und enzymkinetisch bzw. zellbiologisch untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, daß [DAT-Sar]3CsA auch ohne die Mitwirkung eines Cyclophilins die Phosphatase-Aktivität von Calcineurin inhibieren kann. In diesem Zusammenhang wurde außerdem geprüft, inwieweit die verwendeten Substanzen die Aktivierung anderer Signalwege in humanen T-Lymphozyten beeinflussen können. Leider wird durch [DAT-Sar]3CsA auch die PPIase-Aktivität von Cyclophilin gehemmt, so daß in vivo noch immer keine klare Abgrenzung von CaN- und Cyclophilin-Effekten möglich ist. Zukünftige Arbeiten müssen klären, ob durch Modifizierung der [DAT-Sar]3CsA-Struktur neue Derivate geschaffen werden können, die gezielt nur die Proteinphosphatase CaN inhibieren können. Neben der großen klinischen Relevanz einer solchen Substanz zur nebenwirkungsarmen Medikation bei immunologischen Erkrankungen, existiert auch auf der Seite der Grundlagenforschung ein großes Interesse. Mit dieser Substanz wäre es möglich, die Involvierung von CaN in das komplizierte Signal-Netzwerk der Zelle schrittweise aufzuklären.

The number of immunological diseases such as allergy or autoimmune diseases increases strongly in the last years. An other unwanted reaction of the immune system is the graft versus host-reaction. The immune system of a non-immunosuppressed organism reacts on a transplantated tissue with a dangerous rejection. In this cases a modulation and suppression of the immune response is essential. With the discovery of the immunosuppressive properties of Cyclosporin A (CsA) and Tacrolimus (FK506) began a new era in immunopharmacology. These were the first immunosuppressive drugs that allowed selective immunoregulation of T cells without excessive toxicity. Beside CaN inhibition, however, CsA and FK506 have multiple biochemical effects due to their action in a gain of function model that requires prior binding to immunophilic proteins. CsA achieves immunosuppressive activity by complex formation with the PPIase cyclophilin and subsequent binding of the binary complex to and inhibiting protein phosphatase 2B (calcineurin). Complexes of non-immunosuppressive cyclophilin binding cyclosporin analogues do not inhibit protein phosphatase 2B, suggesting a crucial role for this enzyme in T cell activation. We have screened a substance pool with 2000 substances and identified gossypol as a new calcineurin inhibitor. The biochemical characterization of gossypoI was one subject of this work. By studying gossypol derivatives we could show that gossypol may serve as a lead for the development of specific and potent CaN inhibitors active in the nanomolar range, and with improved specificity for CaN while discriminating against other gossypol-sensitive enzymes. Additionally the cyclosporin derivatives [DAT-Sar]3CsA, [AD-Ser]8CsA and [Ac-MeBmt]1CsH were characterized in vitro and in vivo. Surprisingly, the substance [DAT-Sar]3CsA is the first cyclosporin, which is able to inhibit the enzyme activity of calcineurin in a cyclophilin-independent manner. Unfortunately this substance inhibits the PPIase activity of cyclophilin and therefore all PPIase mediated pathways too. Thus, with [DAT-Sar]3CsA is it not possible to differentiate between calcineurin and cyclophilin specific effects in the cell. Nevertheless, [DAT-Sar]3CsA represents a starting point for the development of potent monospecific calcineurin inhibitors in the future.

Keywords:
Ser/Thr-Proteinphosphatase, Calcineurin, Cyclosporin A, Gossypol, Inhibitor, NFAT, PPIase, T-Zelle, Testung, Charakterisierung

Ser/Thr protein phosphatase, calcineurin, cyclosporin A, gossypol, inhibitor, NFAT, PPIase, T cell, screening, characterization

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Inhaltsverzeichnis
Titelblatt, Inhaltsverzeichnis, Abkürzungsverzeichnis
1 Einleitung (1-31)
2 Zielstellung der Arbeit (32)
3 Material und Methoden (33-58)
4 Ergebnisse (59-104)
5 Diskussion (105-122)
6 Zusammenfassung (123-124)
7 Anhang: Literatur