Nicole Dürrschmidt

Regulation der NAD(P)H-Oxidase und LOX-1 durch vasoaktive Substanzen und laminare Schubspannung im kardiovaskulären System

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt an der Mathematisch-Naturwissenschaftlich-Technischen Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 22.05.2003

Abstract
Die primäre Ursache von Herz-Kreislauferkrankungen ist häufig die Arteriosklerose. Ein Risikofaktor für die Entstehung von Arteriosklerose ist eine erhöhte Bildung von Superoxidanionen . Die Hauptquelle der -Bildung in der Gefäßwand ist die NAD(P)H-Oxidase. Dieses Enzym besteht aus vier Untereinheiten: gp91phox, p22phox, p47phox und p67phox. Zusätzlich konnte in der Arbeit die gp91phox-homologe Untereinheit Nox4 in den humanen Endothelzellen der Nabelschnurvene (HUVEC) identifiziert werden. Die Funktion von Nox4 neben der katalytischen Untereinheit gp91phox ist jedoch noch nicht verstanden.
Es wurde der Einfluss des pro-arteriosklerotisch wirkenden Endothelin-1 (ET-1) auf die Regulation der NAD(P)H-Oxidase-Untereinheiten untersucht. Die mRNA-Expression wurde mit Hilfe der Standard-kalibrierten RT-PCR quantifiziert. ET-1 induziert ET-1-Rezeptor B (ETB)-abhängig die gp91phox-mRNA-Expression. Die Induktion von gp91phox ist verbunden mit einer erhöhten Bildung von , die durch die Coelenterazin-vermittelte Chemilumineszenz quantifiziert wurde. Die oxidieren das low-density Lipoprotein (LDL) zu oxLDL. Dieses wird vom oxLDL-Rezeptor LOX-1 in die Endothelzellen aufgenommen. ET-1 induziert ebenfalls ETB-abhängig die Expression von LOX-1 und die endotheliale oxLDL-Aufnahme. Die Aufnahme von oxLDL wurde mit Hilfe von Fluoreszenz-makiertem oxLDL bestimmt. Angiotensin II (Ang II) induziert ebenfalls die Expression von gp91phox und die -Bildung in HUVEC. Auch konnte gezeigt werden, dass Ang II die Expression von LOX-1 erhöht. Aufgrund der induzierten -Bildung und oxLDL-Aufnahme scheinen ET-1 und Ang II eine wichtige Rolle bei der Entstehung von Arteriosklerose zu spielen.
Arterielle laminare Schubspannung wirkt dagegen anti-atherosklerotisch durch Hemmung der ET-1-Freisetzung und der Expression des Angiotensin-Konvertierungsenzyms (ACE) und durch Induktion der Freisetzung des vasoprotektiven NO. Es wurde daher auch der Einfluss von laminarer Schubspannung auf die Regulation der NAD(P)H-Oxidase untersucht. Arterielle laminare Schubspannung vermindert die Expression von gp91phox, Nox4 und p47phox. Diese Herabregulation erfolgt ETB-Rezeptor- und Angiotensin Rezeptor Typ 1 (AT1)-abhängig. Die mRNA-Expression von gp91phox, jedoch nicht von Nox4, wird durch NO reguliert. Die Applikation von arterieller laminarer Schubspannung inhibiert ebenfalls -Bildung, die mittels der Cytochrom c-Methode quantifiziert wurde. Dies zeigt, dass die katalytische Untereinheit gp91phox einen stärkeren Einfluss auf die endotheliale -Bildung hat als Nox4. Arterielle laminare Schubspannung reduziert auch die oxLDL-Aufnahme in die Endothelzellen. Dieser neue Mechanismus könnte somit zur vasoprotektiven Wirkung von arterieller laminarer Schubspannung beitragen.
Eine Standardtherapie zur Behandlung von Bluthochdruck und Herzinsuffizient ist die Gabe von ACE-Hemmern. In klinischen Studien wurde der Einfluss von ACE-Hemmern auf die Expression der NAD(P)H-Oxidase-Untereinheiten im linken Ventrikel von Patienten mit Herzinsuffizient untersucht. Die Protein-Expression von gp91phox, Nox4, p47phox und p67phox wurde durch die Gabe von ACE-Hemmern herabreguliert. Aufgrund der anti-oxidativen Eigenschaften des Myokardgewebes war es nicht möglich, die -Bildung in den Proben zu bestimmen. Jedoch könnte die verminderte Expression der Untereinheiten auf ein anti-oxidatives Potential der ACE-Hemmer hinweisen.

Atherosclerosis is the primary cause of heart disease. A risk factor of atherosclerosis is the increased generation of superoxide anions . The NAD(P)H oxidase is the main source of the endothelial generation. This enzyme consists of four subunits: gp91phox, p22phox, p47phox and p67phox. Furthermore, Nox4 was identified as a novel homolog of the catalytic subunit gp91phox in human umbilical vene endothelial cells (HUVEC). However, the structure and function of the complex is not well understood in endothelial cells.
In this work, the influence of proatherosclerotic endothelin-1 (ET-1) on regulation of different NAD(P)H oxidase subunits including Nox4 was analysed. The mRNA expression was quantified by standard calibrated competitive RT-PCR. ET-1 induced gp91phox mRNA expression after by an ET-1 receptor type B (ETB)-mediated pathway. The induction of gp91phox coincided with an increased generation as quantified by coelenteracine-mediated chemiluminescence. The generated oxidates low-density lipoprotein (LDL) to oxLDL. The oxLDL is taken up by the lectin-like oxLDL receptor LOX-1. Therefore, in further studies the effect of ET-1 on expression of LOX-1 was investigated. ET-1 induced the expression of LOX-1. The oxLDL uptake of HUVEC was quantified by fluorescence-labeled oxLDL. ET-1 stimulated oxLDL uptake via ETB. Angiotensin II (Ang II) also augmented NAD(P)H oxidase expression and generation in HUVEC. Ang II induced LOX-1 expression as well. On the basis of this increased generation and oxLDL uptake, ET-1 and Ang II could promote endothelial dysfunction and development of atherosclerosis.
Arterial laminar shear stress is known as an antiatherosclerotic stimulus. Laminar shear stress inhibits the release of ET-1 and the expression of angiotensin converting enzyme (ACE) and induces the release of vasoprotective nitric oxide (NO). In further studies, the effect of laminar shear stress on regulation of NAD(P)H oxidase was investigated. Arterial laminar shear stress downregulated the expression of gp91phox, Nox4 and p47phox. This downregulation was mediated by ETB receptor and angiotensin receptor type 1 (AT1). The mRNA expression of gp91phox, but not of Nox4, was regulated by NO. The application of arterial laminar shear stress inhibited generation as measured by cytochrom c assay by an NO-mediated mechanism. These data suggest, that the catalytic subunit gp91phox could have an higher impact on endothelial generation than its homolog Nox4. Arterial laminar shear stress reduced the oxLDL uptake in endothelial cells, too. This new mechanism might contribute to the vasoprotective properties of arterial laminar shear stress.
A standard therapy of hypertension and heart failure is the treatment with ACE inhibitors. In clinical studies, the influence of ACE inhibitor therapy on expression of NAD(P)H oxidase subunits in the left ventricle of patients with heart failure was investigated. Protein expression of gp91phox, Nox4, p47phox and p67phox was downregulated by ACE inhibitor treatment. Because the antioxidative capacity of human myocardium we were not able to measure generation in these tissues. Nevertheless these data suggest an antioxidative potential of ACE inhibitor therapy.

Keywords:
Arteriosklerose, oxidativer Stress, Superoxidanionen, Endothelzellen, NAD(P)H-Oxidase, LOX-1, Endothelin-1, Angiotensin II, laminare Schubspannung, ACE-Hemmer

Atherosclerosis, oxidativ stress, superoxide anion, endothelial cells, NAD(P)H oxidase, LOX-1, endothelin-1, angiotensin II, laminar shear stress, ACE inhibitor

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Inhaltsverzeichnis
Titelblatt, Inhaltsverzeichnis, Abkürzungsverzeichnis
1 Einleitung (1-11)
2 Material und Methoden (12-34)
3 Ergebnisse (35-65)
4 Diskussion (66-78)
5 Zusammenfassung (79-81)
6 Literatur (82-95)
Publikationen, Übersichtsarbeiten und Kongressbeiträge