Batsuch Dordschbal

Aktivität und Regulation von Phospholipase A2 in der Plasmamembran von Eschscholzia californica

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt an der Mathematisch-Naturwissenschaftlich-Technischen Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 20.03.2003

Abstract
Zellsuspensionen von Eschscholzia californica reagieren auf einen Hefe-Elicitor (Glycoproteinfraktion) mit der Bildung von Phytoalexinen (Benzophenanthridin-Alkaloiden), die einen wesentlichen Zweig der Pathogenabwehr darstellen.
Bei der Suche nach sehr frühen Ereignissen nach Elicitorkontakt wurde die Aktivierung einer PLA2 entdeckt. In Analogie zu tierischen Zellen stellen Produkte Phospholipase-katalysierter Reaktionen häufig in Pflanzen Signalmoleküle dar.
Im Mittelpunkt der vorliegenden Arbeit standen Experimente zur analytischen und zellbiologischen Charakterisierung der PLA2-Aktivität von Eschscholzia californica-Kulturen und ihre Aktivierung nach Elicitorkontakt.
Die Aktivität von PLA2 in den gereingten Plasmamembran-Vesikeln aus Eschscholzia californica wurde mit den fluoreszenzmarkierten Substraten BPC (ein doppelt BODIPY- substituiertes Phospholipid) und BEPC (ein einfach BODIPY- substituiertes Ether-Phospholipid) nachgewiesen. Dies erfolgte hauptsächlich durch die Extraktion und Identifizierung der Hydrolyseprodukte nach DC-Trennung. Die Messung der Fluoreszenzintensität der BODIPY-markierten Lysophosphatidylcholine (BELPC bzw. BLPC) auf der DC-Platte erlaubte eine empfindliche Quantifizierung der PLA2-Aktivität. MALDI-TOF-MS wurde erstmals zur Identifizierung und Quantifizierung genuiner Phospholipide und Lysophospholipide in pflanzlichen Extrakten eingesetzt. In den Plasmamembranen sind vorwiegend die Lysophosphatidylcholine (LPC) 18:2, 18:1 und 16:0 nachweisbar. In den Zellen ist LPC 18:1 das dominierende Lysophospholipid. Die Aktivierung von PLA2 nach Elicitorkontakt scheint transient. Der Grund dafür ist wahrscheinlich die rasche Metabolisierung (vermutlich Reacylierung) des gebildeten LPC-Derivats. Letzteres konnte mit BODIPY-markiertem LPC in Zellsuspensionen nachgewiesen werden. BODIPY-markiertes LPC wird von den Zellen , nicht aber von PM-Vesikeln metabolisiert, wobei ein Produkt entsteht, welches mit dem BODIPY-Phospholipid Rf-gleich ist.

Cultured cells of Eschscholzia californica respond to a yeast elicitor (glycoprotein fraction) with overproduction of phytoalexine (benzophenanthridine alkaloids). It is a essential path of pathogen-defense in plants.
In analogie to mammalian cells the products of phospholipases represent signal molecules in plants.
The main goal of the present work was to characterize PLA2 in cultured cells of Eschscholzia californica after elicitor-contact.
The activity of a purified plasma membrane (PM) bound phospholipase A (PLA) was detected with fluorogenic phospholipids BPC (double-labeled with BODIPY) and BEPC (single-labeled with BODIPY, a ether phospholipid). The activity of enzyme measured mostly by extraction and identification of the hydrolyse-products after separation on the thin-layer-chromatographie.
The measurment of fluorescence of the lysophosphaditylcholine (BELPC and BLPC) permits a very sensitive quantification of PLA2-activity.
MALDI-TOF-MS was applied first for the identification and quantification of genuine phospholipids and lysophospholipüids in extracts of plants. In the plasmamembranes mainly the lysophosphaditylcholie (LPC 18:2, 18:1 and 16:0) are detectable.In the cells LPC 18:1 is the dominant lysophospholipid. The activition of PLA2 after the contact with the elicitor is apparently transient. The reason is propably the metabolization (likely reacylation) of the arised LPC-derivate. The last was proved with BODIPY-labeled LPC in suspensions cell-cultures.
BODIPY-labeled LPC is metabolized from the cells but not from PM-vesicels. It is a originates product with resemples the BODIPY-phospholipid Rf.

Keywords:
kalifornischer Goldmohn, Pflanzenpathogenabwehr, Phospholipase A, Plasmamembran, Elicitor, BODIPY, Lysophosphaditylcholin, MALDI-TOF-MS

Eschscholzia californica, plant-pathogen-defense, phospholipase A, plasmamembrane, elicitor, BODIPY, Lysophosphaditylcholine, MALDI-TOF-MS

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Inhaltsverzeichnis
Titelblatt, Inhaltsverzeichnis, Abkürzungen (1, I-V)
1. Einleitung (1-10)
2. Materialien und Methoden (11-24)
3. Ergebnisse und Diskussion (25-70)
4. Zusammenfassung (71-72)
5. Literaturverzeichnis (73-83)