Sven Evers

Protein-Phosphorylierungen im Signaltransfer zur Aktivierung des Alkaloidstoffwechsels in Eschscholzia californica

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt an der Mathematisch-Naturwissenschaftlich-Technischen Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 27.08.2003

Abstract
In Suspensionszellen von E. californica wird die Bildung von Benzophenanthridin-Alkaloiden durch eine Glykoprotein-Fraktion aus Hefe (Saccharomyces) ausgelöst. Niedrige Konzentrationen dieses Elicitors aktivieren einen Signalweg, welcher eine transiente zytoplasmatische Ansäuerung als notwendigen und hinreichenden Schritt enthält. Die Produktion reaktiver Sauerstoffspezies oder von Jasmonaten kann unter solchen Bedingungen nicht beobachtet werden, während beide Ereignisse bei hohen Elicitorkonzentrationen (>> 1 µg/ml) feststellbar sind. Inhibitorstudien in einem neu entwickelten miniaturisierten Kultivationssystem mit hohem Probendurchsatz weisen auf die Einbindung von Protein-Tyr-Kinasen in die pH-abhängige Signalkette hin. Die immunologische Untersuchung von Phospho-Proteinen führte zur Detektion zweier Banden bei 46 und 49 kDa, die nach Elicitorkontakt einer transienten Phosphorylierung an Tyr unterliegen. Zwei ausgewählte Tyrphostine haben sich als wirkungsvolle Inhibitoren der detektierten Protein-Tyr-Phosphorylierung erwiesen und vermindern ebenso die elicitorausgelöste Alkaloidbiobildung. Die Aktivierung der Alkaloidbildung durch experimentell ausgelöste zytoplasmatische Ansäuerung wird durch diese Inhibitoren ebenfalls verhindert, obwohl die 46 und 49 kDa Proteine unter solchen Bedingungen nicht phosphoryliert werden. Daher werden zusätzliche Tyr-phosphorylierte regulatorische Proteine in der untersuchten Signalkette erwartet.

Benzophenanthridine-alkaloid production in suspension cultures of Eschscholzia californica can be induced by a yeast glycoprotein preparation. Low concentrations of this elicitor activate a signal path that includes a transient cytoplasmic acidification as a necessary and sufficient element. No generation of reactive oxygen species or increase of jasmonate was detected while these both events occur at high elicfitor concentrations (>> 1 µg/ml). Inhibitor studies in a newly developed, miniaturized high troughput culture system indicated the involvement of protein Tyr-kinases in the pH-dependent signal chain. Immunological detection of phosphoproteins visualized two bands at 46 and 49 kD that were transiently phosphorylated at Tyr after elicitor contact. Two selected tyrphostines proved to be powerful inhibitiors of the observed protein Tyr-phosphorylation and likewise inhibited the elicitor- triggered alkaloid production. The induction of alkaloid biosynthesis by experimental pH shifts was reduced by the same inhibitors though the 46 and 49 kD proteins were not phosphorylated under such conditions. Thus, more Tyr-phosphorylated proteins with signal character are to be expected in the underlying signal chain.

Keywords:
cell biology, cell culture, immunoassay, signal transduction, protein-phosphorylation

cell biology, cell culture, immunoassay, signal transduction, protein-phosphorylation

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Inhaltsverzeichnis
Titelblatt, Inhaltsverzeichnis, Abkürzungen (2, I-V)
1 Einleitung und Problemstellung (1-19)
2 Material und Methoden (20-34)
3 Ergebnisse (35-76)
4 Diskussion (77-87)
5 Zusammenfassung (88-89)
6 Literatur (90-97)
7 Anhang (98-101)
Publikationen und wissenschaftliche Beiträge