Guntram Drutkowski

Inhibitoren der Eicosanoidbiosynthese: Darstellung neuer Amidrazonderivate und Entwicklung einer Testmethode auf Basis humanen Vollblutes

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt an der Mathematisch-Naturwissenschaftlich-Technischen Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 12.09.2003

Abstract
Aufbauend auf bekannte Synthesevorschriften wurden ausgehend von 2-Chlor-1,3-dicarbonyverbindungen über die Zwischenstufe der Carbonsäurearylhydrazonoylchloride mittel Japp-Klingemann-Reaktion Amidrazone synthetisiert. Diese Amidrazone dienten als Ausgangsstoffe für Reaktion mit Carbonylverbindungen zu 4,5-Dihydro-1H-1,2,4-triazolen, 1H-1,2,4-Triazolen, Naphthotriazepinen und einem neuartigen 1,6-Dihydro-1,2,4-triazin. Weiterhin wurden Amidrazone mit zweifacher Substitution am Stickstoff N2 dargestellt. Die neu erhaltenen Verbindungen wurden spektroskopisch und elementaranalytisch charakterisiert.
Zur Bestimmung der inhibitorischen Aktivität neu synthetisierter Verbindungen gegenüber den Enzymen der Arachidonsäurekaskade wurde ein entsprechendes Testsystem entwickelt. Die Testbedingungen wurden systematisch untersucht und optimiert. Als Ergebnis wurde eine Testmethode entwickelt, die ein schnelles und kostengünstiges Screening auf die Hemmaktivität von Substanzen erlaubt.
Das Testsystem arbeitet mit humanem Vollblut. Die Stimulation der Enzyme erfolgt mit Calcium-Ionophor A23187, Calcium- und Magnesium-Ionen sowie Arachidonsäure. Die Quantifizierung der Eicosanoide erfolgt nach Festphasenextraktion und anschließender HPLC-Analytik mittels UV-Detektion gegen den internen Standard PGB1. Mit dem Assay lassen sich fünf Arachidonsäuremetaboliten, die aus dem Stoffwechsel von vier Enzymen hervorgehen bestimmen (5-LOX: LTB4, 5-HETE, 12-LOX: 12-HETE, 15-LOX: 15-HETE, COX-1: 12-HHT).
Die IC50 Bestimmung von vier in der Literatur beschriebenen Standardinhibitoren (NDGA, Zileuton, Indometacin, ASS) ergab eine sehr gute Übereinstimmung mit den Literaturwerten.

Starting from 2-chloro-1,3-dicarbonyl-compounds with carbonic acicd arylhydrazonoyl chlorides as intermediates were synthesised amidrazones using known reactions (Japp-Klingemann-reaction). The amidrazones were used as educts for reactions with carbonylcompounds led to 4,5-dihydro-1H-1,2,4-triazoles, 1H-1,2,4-triazoles, naphthotriazepines and a 1,6-dihydro-1H-1,2,4-triazine. Furthermore were synthesised amidrazones with a double substition at the nitrogen N2. The new compounds were characterised by spektroscopic methods and by elementary analysis.
To determine the inhibitory activity of the new compounds against the enzymes of the arachidonic acid cascade was developed an assay. Testing conditions were analysed and optimised sytematically. The result was a method, which enables to determine the inhibitory activity fast and cost-effective.
The assay is based on human whole blood. Stimulation of the enzymes is carryed out by adding calcium-ionophor A23187, caclium- and magnesium-iones and arachidonic acid. To determine the eicosanoides solid-phase-extraction and HPLC with UV-detection were used. PGB1 was used as internal standard.
The assay enables to quantify five arachidonic-acid-metabolites synthesied by four enzymes (5-LOX: LTB4, 5-HETE, 12-LOX: 12-HETE, 15-LOX: 15-HETE, COX-1: 12-HHT).
Calculation of IC50 values of four well known inhibitors (NDGA, zileutone, indometacine, aspirine) resulted in a good agreement of values which were determined with the values given in literature.

Keywords:
Amidrazone, Japp-Klingemann-Reaktion, Arachidonsäure, Cyclooxygenase, Lipoxygenase, Vollbluttestsystem, HPLC, UV-Detektion

Amidrazone, Japp-Klingemann-Reaction, arachidonic acid, cyclooxygenase, lipoxygenase, human whole blood, HPLC, uv-detection

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Inhaltsverzeichnis
Titelblatt, Inhaltsverzeichnis, Verzeichnis der Abkürzungen und Symbole, Verzeichnis der Abbildungen, Schemata und Tabellen (1, I-IX)
1 Einleitung (1-7)
2 Synthese von Hydrazonderivaten (8-48)
3 Entwicklung eines Vollbluttestsystems (49-111)
4 Zusammenfassung (112-113)
5 Literaturverzeichnis (114-132)
Anhang (1, X-XXXIX)
Publikationsliste, Posterpräsentationen