Katrin Eisert

Immunphänotypisierung von tumorinfiltrierenden Lymphozyten mittels Durchflusszytometrie

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades Doktor der Medizin (Dr. med.) vorgelegt an der Medizinischen Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 04.04.2003

Abstract
In dieser Arbeit wurden die phänotypischen Eigenschaften von tumorinfiltrierenden Lymphozyten (TIL) aus frischen Gewebeproben von Patienten mit Tumoren unterschiedlicher Herkunft untersucht. Dabei galt die Suche prognostischen Zusammenhängen zwischen bestimmten Expressionsmustern von Oberflächenantigenen und der Überlebenszeit von Patienten mit nichtkleinzelligen Lungenkarzinomen (NSCLC) gesucht. Der zweite Teil der Arbeit beschäftigte sich mit dem Vergleich phänotypischer Eigenschaften von TIL verschiedener maligner Primärtumoren und Metastasen.
Die gesamte Untersuchungsgruppe umfasste 303 Patienten mit Tumordiagnose (125 Lungen-, 116 Nierenzell-, 21 Magen-, 4 Mamma-, 10 Harnblasen-, 7 Ösophagus- und 5 Kolon-/Rektumkarzinome, 20 Lungenmetastasen, 5 Hirntumore), welche sich an der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg einer chirurgischen Therapie unterzogen. Nach Gewinnung und Aufbereitung der frischen Tumorresektate erfolgten die Immunfluoreszenzfärbung mit einer Kombination aus Fluorescein (FITC)- und Phycoerythrin (PE)-markierten monoklonalen Antikörpern (mAK) und Analyse mittels Durchflusszytometer. Die resultierenden Daten wurden mit Hilfe univariater und multivariater Analysemodelle (Kaplan-Meier-Modell, Cox-Regressionsmodell, Allgem eines lineares Modell) statistisch ausgewertet.
Ein Zusammenhang zwischen der Überlebenswahrscheinlichkeit und der Höhe des Anteils der B-Zellen, T-Zellen und natürliche Killerzellen (NK-Zellen) an den TIL konnte statistisch nicht nachgewiesen werden. Dies gilt ebenfalls für CD4+, CD8+, HLA-DR+, CD56+ und/oder CD16+, CD13+, CD25+, CD57+, CD45RO+, CD69+, CD49a+ tumorinfiltrierende T-Zellen (TITL) sowie das Verhältnis CD4+/CD8+ TITL. Für Lungentumorpatienten war eine moderate Expression von CD11b, CD26 bzw. CD54 gegenüber einer geringen CD11b-, CD26- bzw. CD54-Expression mit einem signifikant geringeren Sterberisiko (p < 0,05) assoziiert. Im Ergebnis dieser Untersuchung ist es bisher nicht möglich, aus den hier in der Flowzytometrie gewonnenen Daten zum T-Zellphänotyp und zur lymphozytären Zusammensetzung eindeutige Aussagen zur Prognose der NSCLC-Patienten abzuleiten.
Es war nachzuweisen, dass die Expression der untersuchten Oberflächenantigene in den 125 Lungen- und 116 Nierenzellkarzinomen wesentlich von der Tumorentität abhängt. Die Faktoren Alter und Geschlecht der Patienten und der Tumorsubtyp zeigten hier eine geringe Relevanz. Metastasen und ihre Primärtumoren scheinen sich in ihrem TIL-Profil zu ähneln. Dies konnte am Beispiel der Lungenmetastasen von Nierenzellkarzinomen und primären Nierenzellkarzinomen, sowie Lungenmetastasen von Mammatumoren und primären Mammatumoren belegt werden. Bei der vergleichenden Gegenüberstellung der Magen-, Harnblasen-, Ösophagus-, Kolon-/Rektumkarzinome und Hirntumore ließen sich aus den phänotypischen Eigenschaften der TIL charakteristische Muster ableiten.

Tumor-infiltrating lymphocytes (TIL) of different kinds of tumor were characterized with respect to their expression of cell surface molecules (immunophenotype). The aim of this study was to look for significant correlations between the patterns of surface molecules and the survival of patients with non-small cell lung cancer (NSCLC). Furthermore, we compared the immunphenotype of different primary tumors and/or metastases.
303 tumor probes resected at the Martin Luther University Halle-Wittenberg were investigated (125 lung cancers, 116 renal cell carcinomas, 21 tumors of the stomach, 4 of mamma, 10 of bladder, 7 of oesophagus, 5 of colon, 5 of brain, and 20 of lung metastases). After preparation of lymphocytes by density centrifugation, cells were stained with a combination of a fluorescein (FITC)- and a phycoerythrin (PE)-labeled monoclonal antibody specific for different surface molecules and analysed in a flow cytometer. The statistical analyses included uni- and multivariate models (Kaplan-Meyer Method, Cox regression Model, General Linear Model).
We found no significant correlation between survival of lung cancer patients and the percentages of tumor-infiltrating B lymphocytes, T cells and natural killer (NK) cells. Similarly, no significant correlation could be found between survival and CD4+, CD8+, HLA-DR+, CD56+ and/or CD16+, CD13+, CD25+, CD57+, CD45RO+, CD69+, CD49a+ TIL or the ratio CD4+/CD8+ TIL. We found only an association with patients survival of the percentage of CD11b+-, CD26+- and CD54+ tumor infiltrating T cells (significant only in case of moderate expression). Summarizing our results, we cannot give a clear prediction for the patientís prognosis with the surface molecules investigated in this study.
Comparing TIL of renal cancer und lung cancer, we found several peculiarities of immunophenotype. Age and gender of patients as well as the histological subtype of a tumor had a smaller influence on the surface molecules of TIL. We found similarities between phenotype of metastases and the appropriate primary tumor. Last not least, specific patterns were described for the TILís immunophenotype of tumors of stomach, bladder, oesophagus, colon and brain.

Keywords:
tumorinfiltrierenden Lymphozyten (TIL), Immunphänotypisierung, nichtkleinzellige Lungenkarzinome (NSCLC), Durchflusszytometer

tumor-infiltrating lymphocytes (TIL), immunphennotype, non-small cell lung cancer (NSCLC), flow cytometer

Online-Dokument im PDF-Format (3.071 KB) mit integrierter Gliederung.

Inhaltsverzeichnis
Titelblatt, Referat, Abstract, Inhaltsverzeichnis
1. Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen (1)
2. Einleitung und Problembehandlung (2-10)
3. Material und Methoden (10-18)
4. Ergebnisse (19-39)
5. Diskussion (40-57)
6. Tabellen und grafische Darstellungen (58-70)
7. Literaturverzeichnis (71-79)
8. Thesen (80-81)