Peter Dürrschmidt

Entfaltung und Autoproteolyse der neutralen Protease aus Bacillus stearothermophilus und einer Disulfid-modifizierten Variante

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt an der Mathematisch-Naturwissenschaftlich-Technischen Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 03.12.2003

Abstract
Die Stabilisierung von Proteinen zum Erhalt ihrer biologischen Aktivität ist ein Schwerpunkt in der biotechnologischen Forschung. Oft stehen im Mittelpunkt des Interesses Enzyme wie Proteasen - die größte Gruppe der technisch genutzten Enzyme. Mit dem Ziel, den Einfluss lokaler Regionen in der Proteinstruktur auf die Proteinstabilität zu untersuchen, wurden Entfaltung und Autoproteolyse der neutralen Protease aus Bacillus stearothermophilus sowie einer davon abgeleiteten Disulfidvariante miteinander verglichen. Die Disulfidvariante enthält eine gentechnisch eingeführte Disulfidbrücke zwischen den Aminosäurepositionen 8 und 60, was zu einer extremen Steigerung der Thermostabilität führt. Da die thermische Entfaltung von Autoproteolyse begleitet wird, könnte der stabilisierende Einfluss der Disulfidbrücke zum einen auf eine Hemmung der Entfaltung oder zum anderen auf eine Hemmung der Autoproteolyse bzw. auf beides zurückzuführen sein. Um zwischen diesen Möglichkeiten zu unterscheiden, wurde die Autoproteolyse separat mittels Gelelektrophorese und die Entfaltung mittels Fluoreszenz- und Circulardichroismusspektroskopie untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass sich die untersuchten Enzyme nicht signifikant in ihrer Sekundär- bzw. Tertiärstruktur sowie ihrer proteolytischen Aktivität unterscheiden. Auch bei Betrachtung der Guanidinhydrochlorid-induzierten Entfaltungs- und Autoproteolysekinetik erwies sich die Disulfidvariante um 13,2 kJ/mol stabiler als das Wildtypenzym. Experimente in Gegenwart von Isopropanol zur Hemmung der proteolytischen Aktivität zeigten, dass die Entfaltung der neutralen Protease aus Bacillus stearothermophilus über ein Intermediat verläuft, das durch eine erhöhte Flexibilität in der durch die Disulfidbrücke fixierten Region gekennzeichnet ist. Die lokale Entfaltung dieser kritischen Region führt bereits zur Autoproteolyse und damit zur vorzeitigen irreversiblen Inaktivierung bevor eine globale Entfaltung des gesamten Proteins einsetzen kann. Wie eine Analyse der Kalziumabhängigkeit der Entfaltungs- und Inaktivierungsgeschwindigkeit zeigte, ist die Kalziumbindungsstelle III am schwächsten affin und stellt die kritische Region der Proteinstruktur dar. Die Hemmung der lokalen Entfaltung dieser Region kann zum einen durch die Fixierung über eine Disulfidbrücke oder zum anderen über die Einlagerung von Kalziumionen erreicht werden. Es konnte gezeigt werden, dass die spezifische Bindung von vier Kalziumionen an den Bindungsstellen I-IV im Proteinmolekül die Entfaltungs- und Inaktivierungsgeschwindigkeit um fünf Größenordnungen reduziert. Insgesamt bestätigen die Ergebnisse das Modell von der Entfaltungsregion, wonach jedes Proteinmolekül eine labile Region besitzt, an der die Entfaltung beginnt, und die lokale Stabilisierung dieser labilen Region eine globale Stabilisierung des gesamten Proteins zur Folge hat.

The stabilization of proteins to preserve their biological activity is one of the major focus of biotechnological research. Enzymes like proteases are the main objects. The aim of this study was to investigate the influence of local structural regions on protein stability. For that purpose the unfolding and autoproteolysis of the neutral protease from Bacillus stearothermophilus (NPste) and one disulfide variant derived from the wildtyp were compared. The disulfide variant has an engineered disulfide bond connecting the positions 8 and 60 and shows an extreme increase in stability against irreversible thermal inactivation. For thermal unfolding is accompanied by autoproteolysis the stabilizing effect of the disulfide bond can be attributed on the one hand to hindrance of unfolding or on the other hand to restricting autoproteolysis. In order to differentiate between these cases autoproteolysis was measured seperately by gel electrophoresis and unfolding by fluorescence and circular dichroism spectroscopy. Both of the enzymes did not differ significantely neither in proteolytic actvity nor in secundary and tertiary structure. In this study the guanidine hydrochloride induced unfolding was investigated in more detail and revealed a kinetic stabilization of the disulfide bond by 13,2 kJ/mol.
Isopropanol was added to reduce autoproteolytic activity and to study unfolding without the influence of autoproteolysis. Obviously, the unfolding of NPste passes through an intermediate which is characterized by a higher flexibility in the disulfide linked region. Local unfolding of this region leads to autoproteolysis and irreversible inactivation before global unfolding occurs. This critical region proved to be one specific calcium binding site which has the lowest affinity of the four calcium binding sites of the protein. Stabilization against local unfolding of this region can be achieved by incorporation of calcium ions or by the introduction of a disulfide bond. Therefore, the unfolding and autoproteolysis kinetics of NPste are very calcium sensitive and the specific binding of four calcium ions reduces the rate constants by more than five orders of magnitude.
Summarizing the results confirm the model of the unfolding region. This model says that every protein molecule has a sensitive region where unfolding starts. The local stabilization of this labile region should result in a global stabilization of the whole molecule.

Keywords:
Protease, Bacillus stearothermophilus, Disulfidbrücke, Autoproteolyse, Kalzium, lokal, Entfaltung, Stabilisierung, Stabilität, Entfaltungsregion

protease, Bacillus stearothermophilus, disulfide bond, autoproteolysis, calcium, local, unfolding, stabilization, stability, unfolding region

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Inhaltsverzeichnis
Titelblatt, Inhaltsverzeichnis, Abkürzungsverzeichnis
1. Einleitung (1-2)
2. Theorie (3-24)
3. Materialien und Methoden (25-42)
4. Ergebnisse und Diskussion (43-103)
5. Zusammenfassung (104-106)
6. Literaturverzeichnis (107-120)
Publikationen und Tagungsbeiträge