Dimitar Douchkov

Nicotianamine synthase: Gene isolation, gene transfer and application for the manipulation of metal assimilation

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt an der Mathematisch-Naturwissenschaftlich-Technischen Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 27.03.2003

Abstract
Pflanzen haben zwei unterschiedliche Strategien der Eisenaufnahme hervor gebracht. Die nichtproteinogene Aminosäure Nicotianamin (NA) ist eine essentielle Komponente beider Strategien. Zwei NAS-Gene aus Gerste (NASHOR1 und NASHOR2) wurden isoliert und charakterisiert. NAS-Gene kodieren eine neue Klasse von Enzymen. Diese katalysiert die Synthese von NA aus drei Molekülen S-Adenosyl-Methionin sowie die Bildung eines Azetidin-Rings.
Durch Datenbank-Analysen wurden im Arabidopsis-Genom zunächst zwei NAS-ähnliche Gene (NASARA1 und NASARA5) gefunden. Beide Gene wurden kloniert und für Gentransfer-Experimente eingesetzt.
Frühere Beobachtungen führten zu der Vermutung, dass erhöhte interne NA-Konzentrationen zu einer Erhöhung der Eisenassimilation führen könnten. Um dies näher zu untersuchen, wurden die Gene NASHOR1, NASARA1 und NASARA5 in sense und antisense-Orientierung in Nicotiana tabaccum, Lycopersicon esculentum, Arabidopsis thaliana, Lolium perene und Triticum aestivum transformiert und zur Expression gebracht. Entsprechende Genkonstrukte unter Kontrolle des Ubiquitin-Genpromotors aus Mais wurden in tranformiert. Insgesamt wurden mehr 500 transgene Pflanzenlinien erzeugt und teilweise charakterisiert.
Weiterführende Ergebnisse wurden mit dem NASARA5-Gen erhalten. In ausgewählten transgenen Tabaklinien wurden NA-Konzentrationen von bis zu 1300 nmol/g Frischgewicht gemessen. Dies sind die höchsten bisher in einer Pflanze gemessenen Werte. In den transgenen Pflanzen mit erhöhter NA-Konzentration wurde eine signifikant erhöhte Eisenkonzentration nachgewiesen.
Weitere Beobachtungen erlauben die vorläufige Schlussfolgerung, dass die erhöhte NA-Konzentration als Folge der Überexpression des NASARA5-Gens auch zu einer erhöhten Toleranz gegenüber Nickel führt.
Erste, auf einem array-Filter mit 1200 Transfaktor (TF)-Genen von Arabidopsis basierende Versuche zeigen, dass zwei TF-Gene der bHLH-Klasse unter Eisenmangel eine erhöhte Expression zeigen. Laufende Arbeiten sollen klären, ob es sich dabei um Regulatoren der Eisenassimilation handelt.

Plants have evolved at least two different mechanisms of iron acquisition. The non-proteinogenous amino acid nicotianamine (NA) is an essential component of both strategies. Two nicotianamine synthase (NAS) genes of barley (NASHOR1 and NASHOR2) have been isolated and characterized. These enzymes catalyze the synthesis of NA from three molecules of S-adenosyl methionine and the formation of an azetidine ring. NAS genes encode a novel class of enzymes. Database searches identified two NAS-like genes in the genome of A. thaliana, designated as NASARA1 and NASARA5. Gene constructs containing NASHOR1, NASARA1 and NASARA5 genes, in both sense and antisense orientation, have been transformed into N. tabacum, L. esculentum, A. thaliana, L. perenne and T. aestivum. In total, more than 500 independent transgenic lines have been generated and partially analyzed.
Promising results have been obtained with the NASARA5 gene. NA concentrations of about 1300 nmol/g fresh weight could be detected in selected tobacco sense lines. It is among the highest concentration ever detected in plants. The iron concentration in most of the transgenic plants was significantly higher than in wild type. Preliminary data also suggest that the higher NA concentration leads to a higher nickel tolerance of transgenic tobacco plants in comparison to the segregating non-transgenic plants.
Initial experiments based on an array of most of the Arabidopsis transcription factor (TF) genes identified two TF genes with highly induced expression under iron limitation. They belong to the bHLH-TF family. Therefore, they might be candidates for regulators of iron uptake mechanisms.

Keywords:
Ernährungsprobleme, Eisenmangel, Eisenassimilation, chloronerva, Nicotianamin, Nicotianamin-Synthase, Nickel Toleranz, Transgene Pflanzen

nicotianamine, nicotianamine synthase gene, phytosiderophores, iron deficiency, malnutrition, nickel, heavy metal tolerance, transgenic plants, chloronerva

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Inhaltsverzeichnis
Title page, Abbreviations, Table of contents
1. Introduction (1-9)
2. Materials and Methods (10-40)
3. Results (41-79)
4. Discussion (80-90)
Summary (91-92)
Zusammenfassung (93-94)
Literature (95-105)
Appendix: Thesis, Publication of the results, Table of figures