Daniel Hofius

Identifizierung molekularer Faktoren des plasmodesmalen Makromolekül- und Assimilattransportes in Pflanzen

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt an der Mathematisch-Naturwissenschaftlich-Technischen Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 21.08.2003

Abstract
Die interzelluläre Ausbreitung von Pflanzenviren durch Plasmodesmen (PD) erfordert die Funktion Virus-kodierter Transportproteine ("Movement Protein", MP), die über kompatible Interaktionen mit Wirtsfaktoren den symplastischen Transportweg für Photoassimilate und endogene Makromoleküle rekrutieren. Zur Identifizierung von molekularen Faktoren dieser plasmodesmalen Transportprozesse wurden drei Strategien verfolgt. Durch konstitutive und Ethanol-induzierbare Expression des Potato leafroll virus MP (PLRV-MP17) wurden im ersten Ansatz transgene Pflanzen erhalten, deren Plasmodesmen in ihrer Transportfunktion für Assimilate und Viren verändert und durch GFP markiert waren. Basierend auf der MP17-vermittelten Inhibierung des Assimilatexportes und einer starken Wuchsretardierung in transgenen Arabidopsis-Pflanzen wurden aus der EMS-mutagenisierten Population einer MP17:GFP exprimierenden Linie Suppressor-Mutanten mit potentiellen Defekten in MP17-Rezeptoren isoliert. Der zweite Ansatz zielte auf die Isolierung von pflanzlichen Interaktionspartner eines am intra- und interzellulären Virustransport beteiligten potyviralen Capsid Proteins mit MP-ähnlichen Eigenschaften. Unter Verwendung des Zwei-Hybrid Systems in Hefe konnte ein neuartiges DnaJ-ähnliches Protein aus Nicotiana tabacum (NtCPIP1) identifiziert werden, das mit dem CP des Potato virus Y (PVY) interagiert. Die funktionale Bedeutung der Interaktion wurde über die PVY-Infektion transgener Pflanzen verifiziert, die mittels RNAi in der Expression von NtCPIP1 gehemmt waren und verminderte Virusgehalte während der Etablierung der Infektion zeigten. Dies legt nahe, dass durch Interaktion des viralen CP mit DnaJ-ähnlichen Proteinen zelluläre HSP70 Chaperone für den Transport von Potyviren rekrutiert werden. Der dritte Ansatz beruhte auf publizierten Daten, die eine strukturelle Homologie des an der Ausbildung funktionaler PD beteiligten sucrose export defective 1 (SXD1) Proteins mit der VTE1-kodierten Tocopherol-Cyclase zeigten. Die funktionelle Charakterisierung des SXD1-Orthologs aus Solanum tuberosum bestätigte, dass StSXD1 eine Tocopherol Cyclase kodiert und die Tocopheroldefizienz in SXD1-supprimierten Kartoffelpflanzen gleichermaßen zu einer verminderten Stresstoleranz und einer Inhibierung des Assimilatexportes führt. Dies deutet auf eine essentielle Bedeutung von Tocopherol für den Assimilattransport hin.

The intercellular spread of plant viruses through plasmodesmata (PD) requires the function of virus-encoded movement proteins (MP) which recruit plant host factors involved in the symplastic trafficking of photoassimilates and endogenous macromolecules. To identify molecular factors of these plasmodesmal transport processes three different strategies were followed. In a first approach, constitutive and ethanol-inducible expression of the potato leafroll virus MP in transgenic plants was employed to alter PD function for assimilate and virus transport and to visualize PD by GFP. Based on the MP17-induced inhibition of assimilate export and the strong growth retardation in transgenic Arabidopsis plants, an EMS-mutagenised population of a MP17:GFP expressing line was used to isolate suppressor mutants with potential defects in MP17 plant receptors. The second approach aimed at the isolation of plant interaction partners of a potyviral capsid protein (CP) which has been shown to possess MP-like functions and to be essential for intra- and intercellular virus movement. Using the yeast two-hybrid system, a novel DnaJ-like protein was identified that interacts with the CP of potato virus Y (PVY). The functional relevance of the interaction was confirmed by PVY infection of transgenic tobacco plants silenced for NtCPIP1 resulting in reduced virus titre during the establishment of infection. This strongly suggests the involvement of HSP70 chaperones recruited by the binding of viral CP to host DnaJ-like proteins during potyvirus movement. The third approach made use of published data indicating structural homology of the sucrose export defective 1 (SXD1) protein, previously thought to be required for PD function, with the VTE1-encoding tocopherol cyclase. The functional characterisation of the SXD1 ortholog from Solanum tuberosum confirmed that StSXD1 encodes a functional tocopherol cyclase. Furthermore, tocopherol deficiency caused by SXD1-suppression in transgenic potato plants resulted in a reduced stress tolerance and concomitantly in the inhibition of assimilate export. This reveals an essential role of tocopherol for assimilate transport.

Keywords:
Plasmodesmen, Movement Protein, Potato leafroll virus (PLRV), Photoassimilat-Transport, transgene Pflanzen, Capsid Protein, Potyvirus, DnaJ-ähnliche Chaperone, Tocopherol (Vitamin E), sucrose export defective 1 (SXD1)

Plasmodesmata, movement protein, potato leafroll virus (PLRV), photoassimilate transport, transgenic plants, capsid protein, potyvirus, DnaJ-like chaperones, tocopherol (vitamin E), sucrose export defective 1 (SXD1)

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Inhaltsverzeichnis
Titelblatt, Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung (1-16)
2 Material und Methoden (17-28)
3 Ergebnisse (29-96)
4 Diskussion (97-124)
5 Zusammenfassung (125-127)
6 Abkürzungsverzeichnis (128-129)
7 Literaturverzeichnis (130-145)
8 Anhang (146-152)
Publikationsliste