Tatiana Ankudo

Immunomodulation of Brassinosteroid Functions in Seeds of Arabidopsis thaliana (L.)

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt an der Mathematisch-Naturwissenschaftlich-Technischen Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 21.01.2004

Abstract
Brassinosteroide, eine neue Klasse von Phytohormonen, haben essentielle Funktionen bei Wachstums- und Entwicklungsprozessen. Da Brassinosteroide generell an der Pflanzenentwicklung beteiligt sind, wird eine Funktion bei der Samenentwicklung angenommen. In der vorliegenden Arbeit sollte untersucht werden, in welcher Weise Brassinosteroide zur Samenentwicklung beitragen und welche Funktion sie bei der Keimung haben. Um dieses generelle Ziel zu erreichen, wurden die Brassinosteroidfunktionen im Samen durch Immunmodulation blockiert. Als wichtiges Werkzeug wurden spezifische rekombinante Einkettenantikörper selektiert, die entweder an Brassinolid, Castasteron und die Isomere 24-Epibrassinolid und 24-Epicastasteron (Antikörper A30) oder nur an 24-Epiobrassinolid und 24-Epicastasteron (Antikörper A16) spezifisch binden. Die entsprechenden kodierenden Sequenzen wurden in Pflanzenexpressionsvektoren kloniert , die eine Lokalisierung dieser Antikörper im Endoplasmatischen Retikulum von Samenzellen gewährleisten. Hierfür wurden für beide Einkettenantikörpergene die samenspezifischen Promotorem USP und Legumin B4 benutzt. Transgene Arabidopsis thaliana- und Nicotiana tabacum-Pflanzen akkumulierten die rekombinanten anti Brassinosteroidantikörper stabil und vererbbar im Endoplasmatischen Retikulum von Samenzellen. Nichtsegregierende homozygote transgene Linien wurden durch klassische genetische Analye selektiert. Diese Pflanzen akkumulierten den Einkettenantikörper A16 stärker als den Einkettenantikörper A30 im ER. Die rekombinanten Antikörper aus den Pflanzen banden in vitro spezifisch an 24-Epicastasteron. Diese Bindungsaktivität ist für die physiologische Wirkung in vivo essentiell. Die Brassinosteroidfunktionen wurden zu verschiedenen Zeitpunkten der Samenentwicklung durch Immunmodulation untersucht. Die rekombinanten Antikörper wurden zu diesem Zweck entweder unter Kontrolle des USP-Promotors oder unter Kontrolle des LeguminB4-Promotors exprimiert. Bei Expression unter Kontrolle des USP-Promotors konnten die transgenen Proteine schon ab Tag 4 nach der Bestäubung, in großen Mengen ab Tag 8 nach der Bestäubung, nachgewiesen werden. Bei Expression unter Kontrolle des LeguminB4-Promotors konnten die rekombinanten Antikörper ab 8, in großen Mengen ab Tag 9 nach der Bestäubun nachgewiesen werden. Die transgenen Pflanzenlinien wiesen verschiedene morphologische und physiologische Veränderungen auf. Reife transgene Arabidosis-Samen zeigten Veränderungen in Menge und Form der Phytin-haltigen Proteinkörper, was als Folge inadäquater Nährstoffeinlagerung zu deuten ist. Die transgenen Pflanzen zeigten verzögerte Keimung und verzögerte Entwicklung nach der Keimung. Die Modulation der Brassinosteroidfunktionen in keimenden Samen verursachte auch Veränderungen auf molekularer Ebene. Inadäquate Expression wurde für verschiedene Gene nachgewiesen. Veränderungen der transgenen Linien im Nährstoffstatus wurden durch Studien der Expression des Cruciferringenes sowohl auf Transcript- als auch auf Proteinebene demonstriert.

Brassinosteroids represent a new class of plant hormones essential for growth and development. Since BRs are involved generally in plant development, a function in seed germination was presumed. In the present work we wanted to investigate, how contribute brassinosteroids to seed ripening and what function they have in germination. To achieve this general goal, the function of brassinosteroids will be blocked by immunomodulation in seeds.
As an important tool recombinant single-chain Fv antibodies were selected, that either bind to brassinolide, castasterone and there isomer forms 24-epicastaserone and 24-epibrassinolide (A30), or to 24-epicastaserone and 24-epibrassinolide (A16). Their coding sequences were cloned into plant expression vectors for production of these antibodies in the endoplasmatic reticulum of seeds. The A30 and A16 antibody coding genes were used to construct expression cassettes for ER retention under the control of seed specific USP and LeB4 promoters.
The generated transgenic Arabidopsis thaliana and Nicotiana tabacum plants stably and heritably accumulated the anti-brassinosteroids recombinant antibodies in the endoplasmic reticulum of seed cells. Non-segregating homozygous transgenic lines were selected by the classical Mendel analysis. The recombinant antibodies from plant were verified in vitro for specific binding to 24-epicastasterone, essential for the physiological activity in vivo.
The functions of brassinosteroids were investigated by immunomodulation at different time points of seed development. For this propose, the recombinant antibodies were either expressed under control of the USP promoter, were transgenic scFv proteins could be detected already at day 5 after pollination, or under control of the Legumine B4 promoter, were scFv expression was measured firstly at day 8 after pollination. The transgenic lines performed several morphological and physiological alterations. Mature transgenic Arabidopsis seeds carried alterations in number and shape of phytin granules and protein bodies, reflecting to inadequate nutrient storage. Transgenic plants exhibited delay in germination and development after germination. The modulation of brassinosteroid function in the germinating seeds triggered modifications at a molecular level as well. Inadequate expression of several genes was detected. The alterations of the transgenic lines in the nutrient status could be demonstrated by studies on the expression level of the cruciferin gene (described seed storage protein) both at transcript and protein level.

Keywords:
Arabidopsis thaliana, Immunmodulation, Brassinosteroide, Pflanzenhormone, Samen, Samenspeidierproteine, Affymetrix Keimung

Arabidopsis thaliana, Immunomodulation, Brassinosteroids, Plant hormones, Seed, Seed storage proteins, Affymetrix, Germination

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Inhaltsverzeichnis
Title page, List of abbreviations, Contents
1. Introduction (1-12)
2. Materials and methods (13-26)
3. Results (27-51)
4. Discussion (52-57)
5. Abstract (58-59)
6. Zusammenfassung (60-61)
7. References (62-70)