Arndt-Christian Müller

Wertigkeit des Comet Assays zur Detektion

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades Doktor der Medizin (Dr. med.) vorgelegt an der Medizinischen Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 16.03.2004

Abstract
Hintergrund: In den letzten Jahrzehnten wurden In-vitro-Assays etabliert, um schwere unerwünschte Reaktionen von Normalgewebe auf Bestrahlung prätherapeutisch erkennen zu können. In dieser Arbeit wurde der Comet Assay als prädiktiver Test zur Messung der Strahlenempfindlichkeit von Einzelzellen (Gesamtblut und isolierte Lymphozyten) unter dem Einfluß des Radioprotektivums Amifostin verwendet. Untersucht wurde, ob ein potentieller radioprotektiver Effekt von Amifostin (WR-2721) nach In-vivo- und In-vitro-Gabe mit dem Comet Assay detektierbar ist und ob eine Abhängigkeit der Wirkung von WR-2721 bezüglich der Konzentrationen Amifostins und alkalischer Phosphatase (dem Enzym, welches das Prodrug aktiviert) besteht.
Material und Methodik: Untersuchungen zur Reproduzierbarkeit des Comet Assays ergaben, daß die Meßergebnisse (Initialschäden, Reparaturverhalten) innerhalb eines Experiments jederzeit reproduzierbar waren. In-vivo-Applikation von Amifostin: Untersucht wurden Leukozyten von 6 postoperativen Rektumkarzinompatienten vor und nach Infusion von 500mg Amifostin (ohne radio- oder chemotherapeutische Vorbehandlung). In-vitro-Applikation von Amifostin: Frisch isolierte Lymphozyten zweier gesunder Spender wurden bei unterschiedlichen Konzentrationen von alkalischer Phosphatase (0-210U/ml) und Amifostin (0-5000g/ml) inkubiert. Leukozyten und Lymphozyten wurden in-vitro bestrahlt und repariert sowie mit dem alkalischen Comet Assay ausgewertet. Zur Beurteilung der radioprotektiven Wirkung wurden dosismodifizierende Faktoren (DMF) berechnet und der gepaarte T-Test durchgeführt.
Ergebnisse: Der DNS-Schaden nach Bestrahlung wurde durch alleinigen Zusatz von Amifostin in vitro nicht verändert. Die Zugabe von mindestens 0,5-1U/ml alkalischer Phosphatase war erforderlich. Ein signifikanter radioprotektiver Effekt (p<0,05) bestand nach Applikation von allen untersuchten Amifostinkonzentrationen in vitro (250-5000g/ml, Initialschäden) Die mittleren DMF bei 250 und 5000g/ml nach Bestrahlung mit 6Gy betrugen 0,85 und 0,80. Ein vergleichbarer radioprotektiver Effekt wurde nach In-vivo-Gabe von 500mg Amifostin mit einem mittleren DMF von 0,87 gemessen. Interindividuelle Unterschiede bestanden in vitro als auch in vivo.
Schlußfolgerung: 500mg Amifostin intravenös sind eine adäquate radioprotektive Dosis. Die Wirkung ließ sich in vitro selbst bei extremen Konzentrationen von Amifostin nur marginal steigern. Der Comet-Assay ist geeignet, kleine Veränderungen der Radiosensitivität durch Amifostin zu quantifizieren.

Purpose: In the last decades, in-vitro assays were developed to detect possible serious reactions of normal tissue due to irradiation before the treatment. The comet assay - a predictive test - was used to analyse the radiosensitivity of single cells (whole blood and isolated lymphocytes) after incubation with the radioprotector amifostine. The potential radioprotective effect of amifostine (WR-2721) was investigated after in-vitro and in-vivo administration. The influence of increasing concentrations of amifostine and alkaline phosphatase (the enzyme which activates the prodrug) were studied.
Material and Methods: The high reproducibility of the comet assay within experiments was demonstrated by investigations of multiple replicates (initial DNA damages, repair studies). In-vivo administration of amifostine: Blood samples were collected from 6 postoperative rectal cancer patients before and after administration of 500mg amifostine intravenously (no pretreatment with radiation or chemotherapy). In-vitro administration of amifostine: Freshly isolated lymphocytes from two healthy volunteers were incubated with different concentrations of alkaline phosphatase (0-210U/ml) and amifostine (0-5000g/ml). Leukocytes and lymphocytes were irradiated and repaired in-vitro and investigated with the alkaline comet assay. The radioprotective effect was evaluated by calculating dose-modifying factors (DMF) and the paired t-test.
Results: Amifostine alone did not alter the radiation-induced DNA-damage in-vitro. The addition of at least 0.5-1U/ml alkaline phosphatase was required. A significant radioprotective effect (p<0.05) was seen after administration of amifostine in-vitro for all investigated concentrations of amifostine (250-5000g/ml, initial DNA damage) The mean DMF at 250 and 5000g/ml after irradiation with 6Gy were 0.85 and 0.80. A comparable radioprotective effect after in-vivo administration of 500mg amifostine was measured with a mean DMF of 0.87. Interindividual differences were present in-vivo and in-vitro.
Conclusions: 500mg amifostine intravenously yield an adequate radioprotective concentration. The effect was only marginally improved by extremely concentrations of amifostine in in-vitro-experiments. The comet assay is capable of detecting small changes in radiosensitivity by amifostine.

Keywords:
Radioprotektion, Amifostin, Comet Assay, Alkalische Phosphatase, Lymphozyten

Radioprotection, Amifostine, Comet assay, Alkaline phosphatase, Lymphocytes

Online-Dokument im PDF-Format (1.559 KB) mit integrierter Gliederung.

Inhaltsverzeichnis
Titelblatt, Referat, Inhaltsverzeichnis, Abkürzungsverzeichnis (1-2, I-IV)
1 Einleitung (1-4)
2 Methodik (5-15)
3 Ergebnisse (16-40)
4 Diskussion (41-59)
5 Zusammenfassung (60-61)
6 Literaturverzeichnis (62-73)
7 Anlagen (74-77)
8 Thesen (78-79)
Publikationsliste