Judith Hans

Klonierung und Charakterisierung von Flavonoidglucosyltransferasen aus Beta vulgaris L.

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt an der Mathematisch-Naturwissenschaftlich-Technischen Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 23.06.2004

Abstract
Innerhalb der Ordnung Caryophyllales sind Anthocyane funktionell durch Betalaine ersetzt worden (Clement & Mabry, 1996). Der Ausgangspunkt der vorliegenden Untersuchungen war die Tatsache, dass für einen einzigen Vertreter der Caryophyllales, Dorotheanthus bellidiformis (Livingstone daisy, Aizoaceae), zwei regiospezifische Betanidin-Glucosyltransferasen nachgewiesen und charakterisiert wurden (Heuer et al., 1992; 1996; Vogt et al., 1997; 2002). In jungen Beta vulgaris-Pflanzen hingegen wurde im Jahre 1984 von Wyler und Mitarbeitern ein signifikanter Gehalt an cyclo-Dopa-5-O-glucosid detektiert. Folglich wurde eine alternative Glucosidierung auf der Stufe des Intermediates cyclo-Dopa im Rahmen der Betaninbiosynthese diskutiert. Nach Etablierung eines sensitiven Enzymtests wurden verschiedene Vertreter der Caryophyllales auf eine cyclo-Dopa glucosidierende Enzymaktivität hin untersucht, ohne dass eine solche Aktivität nachgewiesen werden konnte. Darüberhinaus konnten die zuvor von Wyler und Mitarbeitern (1984; 2001) in unserem Labor nicht reproduziert werden. Die Untersuchung des cyclo-Dopa-glucosid Gehaltes in B. vulgaris-Pflanzen über einen Zeitraum von acht Wochen zeigte nur Spuren von cyclo-Dopa-glucosid, das vermutlich ein Hydrolyseprodukt des Betanins darstellt (W. Schliemann, unveröffentlicht).
Ein Homologie-Screening, basierend auf der Plant Secondary Product-Glucosyltransferase-Konsensus-Sequenz (PSPG-Box), ermöglichte die Klonierung zweier "full-length" cDNAs, UGT73A4 und UGT71F1 aus einer roten B. vulgaris-Zellsuspensionskultur. Beide Klone zeigten auf Aminosäureebene eine hohe Identität zu den Betanidin-GTs aus D. bellidiformis.
Beide heterolog exprimierten Proteine katalysierten den positionsspezifischen Glucosetransfer von UDP-Glucose auf verschiedene Flavonoide und Betanidin. Beide Enzyme zeigten in vitro eine breite Substratspezifität, waren aber spezifisch bezüglich des Zuckerdonators UDP-Glucose. Die vorliegenden Daten stützen die Hypothese, dass Betanidin-glucosidierende Enzyme ursprünglich aus dem Flavonoidstoffwechsel rekrutiert wurden (Vogt, et al., 1997; Strack et al., 2003). Die Expressionsanalyse zeigte, dass das UGT73A4-Transkript nicht nur in der B. vulgaris-Zellkultur, sondern auch in jungen Pflanzen und in der Stammform Beta maritima akkumulierte. Die UGT71F1 mRNA konnte nur in der Zellkultur mittels RT-PCR detektiert werden.
Ausgehend von Site-directed mutagenesis-Daten wurden mit Hilfe von Homology-Modelling zwei 3D-Strukturmodelle der UGT73A5 aus D. bellidiformis und der UGT73A4 aus B. vulgaris entwickelt. Diese Modelle vermitteln erstmals eine Vorstellung der möglichen Raumstruktur zweier pflanzlicher Glucosyltransferasen der -Gruppe und liefern Ansatzpunkte, die in vitro beobachteten Unterschiede zwischen den beiden homologen Enzymen zu erklären. Semi-empirische Berechnungen anhand des UGT73A5-Modells favorisieren einen SN1-Mechanismus für den Zuckertransfer unter Inversion der Konfiguration, der als eine mögliche Alternative zum in der Literatur vorgeschlagenen SN2-Mechanismus (Kapitonov & Yu, 1999) angesehen werden kann. Die Qualität der hier entwickelten 3D-Modelle wird erst abschliessend beurteilt werden können, wenn die erste Kristallstruktur einer pflanzlichen Glucosyltransferase vorliegt.
Die Untersuchung weiterer Vertreter der Caryophyllales wird notwendig sein, um zu klären, ob eine Glucosidierung auf der Stufe des Betanidins ein generelles Prinzip in Betalain-führenden Pflanzen darstellt oder artspezifisch verschieden abläuft.

In the plant order Caryophyllales, the chromogenic anthocyanins have been replaced by functionally equivalent but biosynthetically different betacyanins (Clement & Mabry, 1996). The starting point of these investigations was the observation that up to now, only for one member of the Caryophyllales, Dorotheanthus bellidiformis (Livingstone daisy, Aizoaceae), two regiospecific betanidin glucosyltransferases have been characterized (Heuer et al., 1992, 1996; Vogt et al., 1997). As the accumulation of considerable amounts of cyclo-Dopa-5-O-glucoside had been reported for Beta vulgaris L. (Chenopodiaceae) by Wyler and co-workers in 1984, the question arose if glucosylation at the betanidin level is an exception or the rule in betacyanin biosynthesis. After development of an sensitive enzyme activity test, several plants from different families of the order Caryophyllales have been screened for activity of a putative cyclo-Dopa-glucosyltransferase, but all attempts to show the existence of such an enzyme activity failed. Furthermore investigation of cyclo-Dopa glucoside accumulation in B. vulgaris plants over eight weeks contradicted the previous published data by Wyler and co-workers (1984, 2001). Only trace amounts of this compound were detectable, most likely liberated from betanin that is in equilibrium with its hydrolytic products, cyclo-Dopa glucoside and betalamic acid (W. Schliemann, unpublished results).
A molecular approach, based on polymerase-chain reaction and degenerated primers derived from the Plant Secondary Product GT consensus sequence, led to the first cloning and functional expression of two full-length cDNAs from B. vulgaris cell suspension culture with high homology to the corresponding enzymes from D. bellidiformis. The open reading frame (orf) of UGT73A4 encodes a protein of 476 amino acids with a molecular mass of 54 kDa, whereas the orf of UGT71F1 encodes a polypeptide of 492 amino acids with a comparable molecular weight, catalyzing the position-specific transfer of glucose from UDP-glucose to different flavonoids and to a very low extent to the chromogenic betanidin. In vitro studies on substrate specificity indicated that both enzymes exhibit a broad substrate spectrum regarding the sugar acceptor, preferring flavonoids with ortho-dihydroxy groups in the B-ring. In contrast the specificity for the sugar-donor was very strict, only UDP-glucose was accepted. From our studies it may be evident that glycosylation of betacyanins is a monophyletic phenomenon originating from enzymes previously involved in flavonoid metabolism. Expression analysis revealed that the UGT73A4 transcript accumulated not only in the cell culture of B. vulgaris, but also in young plants and the ancient form Beta maritia. The UGT71F1 mRNA could only be detected in the B. vulgaris cell suspension culture.
Based on site-directed mutagenesis and a homology modelling approach, two 3D-models of the UGT73A5 from D. bellidiformis and the UGT73A4 from B. vulgaris have been developed. They provide a preliminary insight into the possible tertiary structure of two plant glucosyltransferases, the putative active site and are suitable to explain observed differences between the two homologous enzymes. Semiempirical calculations suggest a SN1-like mechanism of sugar transfer under inversion of configuration () for the UGT73A5 from D. bellidiformis, which may be seen as an alternative towards the SN2-mechanism proposed in literature (Kapitonov & Yu, 1999). Nevertheless the 3D-model structures presented here cannot substitute further investigations by spectroscopic methods, e.g. NMR, and their qualitiy may be finally judged after the first crystal structure of a plant glucosyltransferase is resolved. Further studies on the glucosyltransferase pool of different members of the Caryophyllales will be required to answer the question wether glucosylation at the betanidin level is the rule or an exception throughout betacyanin-synthesizing plants.

Keywords:
Beta vulgaris, Betalaine, Flavonoid- und Betanidin-UGTs, Klonierung, heterologe Expression, Flavonoidprofil, Homologie-Modellierung, katalytischer Mechanismus

Beta vulgaris, Betalains, flavonoid- and betanidin-UGTs, cloning, heterologous expression, flavonoid profile, homology modelling, catalytic mechanism

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Inhaltsverzeichnis
Titelblatt, ‹bersicht zu Veröffentlichung, Vorträge und Poster, Inhaltsverzeichnis, Abkürzungen (1-2, I-VIII)
1. Einleitung (1-10)
2. Material & Methoden (11-29)
3. Ergebnisse (30-71)
4. Diskussion (72-85)
5. Zusammenfassung (86-87)
6. Summary (88)
7. Literatur (89-104)
8. Appendix (105-107)