Hilmar Ebersbach

Neuartige Bindemoleküle für die Diagnostik auf der Grundlage eines Strukturproteins

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt an der Mathematisch-Naturwissenschaftlich-Technischen Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 27.10.2004

Abstract
Antikörper und deren Fragmente sind bei Anwendungen in Diagnostik und Therapie die am häufigsten eingesetzten Bindemoleküle. Dennoch weisen sie zum Teil einige erhebliche Nachteile in Bezug auf ihre Herstellung oder ihre Stabilität auf. Durch die Generierung alternativer Bindemoleküle sollen diese Nachteile vermieden werden. Die Anforderungen an ein alternatives Bindemolekül sind damit eine hohe Stabilität, gute Löslichkeit, eine kostengünstige Herstellung sowie einfache genetische oder chemische Fusion mit Markermolekülen, verbunden mit einer hohen Affinität und Spezifität gegen relevante Zielmoleküle.
Auf der Grundlage des -Kristallins als Gerüstprotein wurden Phage Display Bibliotheken erstellt, in denen acht lösungsmittel-exponierte Aminosäuren in einem -Faltblatt auf genetischer Ebene zufällig substituiert waren. In der vorliegenden Arbeit wurden diese Bibliotheken auf geeignete Varianten des -Kristallins, so genannte AffilinTM-Moleküle, in Bezug auf ihre Bindeeigenschaften gegen verschiedene Zielmoleküle durchsucht. Eine Durchmusterung der humanen -Kristallin Bibliothek CR20 auf Bindemoleküle gegen IgG-Fc führte zur Isolierung von spezifisch bindenden AffilinTM-Moleküle mit Dissoziationskonstanten für IgG-Fc im Bereich von 10-7 M. Drei der IgG-Fc bindenden Varianten wurden biophysikalisch näher charakterisiert. Die Varianten zeigten, im Vergleich zu anderen alternativen Bindemolekülen, moderate Stabilitäten gegenüber GdmHCl und Temperatur. Eine außerordentlich hohe Stabilität zeigten alle untersuchten AffilinTM-Moleküle gegenüber extremen pH Werten. Beispielhaft wurde eine AffilinTM-Moleküle auf die Stabilität in Serum untersucht. Das Protein war für mehr als 6 h zu 100 % in Serum nachweisbar. Die Raumstrukturen des humanen -Kristallins und einer IgG-Fc bindenden Variante konnten mittels Röntgenkristall-strukturanalyse mit Auflösungen bis 1.7 bzw. 2.0 Å bestimmt werden. Dadurch wurde die Annahme bestätigt, dass die zufällige Substitution von acht Positionen die -Faltblattstruktur der Domäne und damit das greek key Faltungsmotiv nicht zerstört. AffilinTM-Moleküle ließen sich sowohl genetisch als auch chemisch mit Markermolekülen ohne Verlust der Bindungsaffinität fusionieren. Durch die Einführung eines C-terminalen linkers mit einem endständigen Cystein war es möglich, einfach und effizient ein AffilinTM-Molekül mehrfach an Phycoerythrin zu koppeln. Bei der anschließenden Analyse des Komplexes konnte eine Dissoziationskonstante von 15 nM gegenüber IgG-Fc und damit ein Aviditätseffekt nachgewiesen werden.
Es konnte gezeigt werden, dass die isolierten AffilinTM-Moleküle die Anforderungen an ein alternatives Bindemolekül für einen Einsatz in der Chromatographie und Diagnostik erfüllen.

Antibodies and their fragments are the most important binding molecules for application in the field of diagnostics, chromatography and therapy. Nevertheless they sometimes show major drawbacks by means of their efficient production or their stability. Antibody analogue binding molecules can be bypassing these disadvantages offering comparable affinity and stability. The requests on an alternative binding molecule are high thermodynamic stability, high solubility and a cost efficient production as well as an easy genetic or chemical fusion to marker molecules, like enzymes or fluorophores, combined with high affinity and specifity to relevant targets.
Phage display libraries based on the -crystallins scaffold, structure proteins derived from vertebrate eye lens, were generated. Eight solvent exposed amino acids in three beta-strands were randomized on the genetic level in these libraries. Here one library was screened for variants of -crystallin, so called AffilinTM-molecules, with binding activity to diagnostic relevant targets. A selection from the human -crystallin library CR20 against IgG-Fc as a target revealed binding active AffilinTM-variants with dissociation constants in the range of 10-7 M. Three of the IgG-Fc binding variants were biophysically characterised. In comparison to other alternative binding molecules, the tested variants show moderate stabilities against denaturation by GdmHCl or temperature. An extraordinary stability was detected against extreme pH values in the range from 1.5 to 12.5. An AffilinTM-molecule was tested for stability in human blood serum, an important criterion for diagnostics. The protein was detectable in serum for more than six hours to 100 %. Structures of human -crystallin and one IgG-Fc binding variant were solved by crystallisation and x-ray diffraction with maximal resolution of 1.7 and 2.0 Å, respectively. This was the improvement of the thesis that randomisation of eight amino acid positions do not destroy the structure of changed -sheet of the n-terminal domain and therefore the greek key topology. Without lost of any binding activity genetic and chemical fusions of AffilinTM-molecules to marker molecules were performed. Using maleiimide chemistry an AffilinTM-molecule was coupled to Phycoerythrin via a c-terminal linker. A following analysis of binding activity of isolated AffilinTM-phycoerythrin conjugate shows dissociation constant to IgG-Fc of 15 nM so an avidity effect by increasing affinity.
The results show that AffilinTM-molecules serve the requests of an alternative binding molecule for an application in chromatography and diagnostic.

Keywords:
AffilinTM, -Kristallin, IgG-Fc, Diagnostik, Phage Display, Kopplung

AffilinTM, -crystallin, IgG-Fc, Diagnostics, Phage Display, Coupling

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Inhaltsverzeichnis
Titelblatt, Abkürzungen, Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung (1-15)
2 Material und Methoden (16-41)
3 Ergebnisse (42-95)
4 Diskussion (96-118)
5 Zusammenfassung (119-120)
6 Literaturverzeichnis (121-131)
Anhang