Michael Bunge

Dioxin-dechlorierende Bakterien in anaeroben Kulturen aus kontaminierten Flußsedimenten

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt an der Mathematisch-Naturwissenschaftlich-Technischen Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 10.02.2004

Abstract
Dioxin-dehalogenierende Kulturen anaerober Bakterien wurden durch aufeinanderfolgende Transfers aus Mikrokosmen gewonnen, die mit kontaminiertem Sediment des Flusses Spittelwasser angelegt wurden. Die Proben wurden aus unterschiedlichen Sedimenttiefen gewonnen und waren stark mit polychlorierten Dibenzo-p-dioxinen und -furanen und anderen halogenorganischen Verbindungen belastet. Die Anreicherungskulturen waren in der Lage, die zugesetzten Modellverbindungen 1,2,3,4-Tetrachlordibenzo-p-dioxin und 1,2,3- und 1,2,4-Trichlordibenzo-p-dioxin (TrCDD) reduktiv zu dehalogenieren. Unterschiedliche Dechlorierungswege wurden beobachtet, die sich in der Bildung der jeweiligen Dechlorierungsendprodukte und dem Verhältnis der Hauptprodukte 1,3- und 2,3-Dichlordibenzo-p-dioxin unterschieden. Reduktive Dechlorierung wurde auch mit Material aus niedriger belasteten Sedimenten nachgewiesen. Die Ergebnisse einer auf dem Nachweis von 16S rDNA basierenden Studie (nested PCR) konnten die Anwesenheit von potentiell dechlorierenden Populationen zeigen, unter anderem von Bakterien der Gattungen Desulfitobacterium und Dehalococcoides, die in allen Kulturen gefunden werden konnten. Das amplifizierte Dehalococcoides 16S rDNA-Fragment war identisch mit der Sequenz des Stammes CBDB1. Dieses Bakterium wurde auf die Fähigkeit hin untersucht, Dioxine reduktiv zu dehalogenieren. Stamm CBDB1 war in der Lage 1,2,3,4-TeCDD, 1,2,3-TrCDD, 1,2,4-TrCDD und 2,3-DiCDD zu dechlorieren, 2-Monochlordibenzo-p-dioxin war das vorläufige Endprodukt. Die unter umwelttoxikologischem Aspekt relevante Verbindung 1,2,3,7,8-Pentachlordibenzo-p-dioxin wurde zu 2,3,7,8-Tetrachlordibenzo-p-dioxin und anderen niedriger chlorierten Verbindungen umgesetzt, darunter 2,7- oder 2,8-DiCDD. Eine weitere Studie konnte zeigen, dass 1,2,3-Trichlorbenzol, welches über ein Zweiphasensystem mit Hexadekan zugeführt wurde, durch die Anreicherungskulturen zu 1,3-Dichlorbenzol dehalogeniert wurde. Während der Chlorbenzol-Dechlorierung nahm die Zahl der Dioxin-Dechlorierer um drei Grössenordnungen zu. Um die an der Dechlorierung beteiligten Organismen zu identifizieren, wurden molekularbiologische Methoden angewendet. Die Restriktionsfragmentlängen-Analyse (RFLP) von 16S rDNA-Genbanken konnte die Anreicherung von zehn verschiedenen Restriktionsmustern zeigen, darunter eines Musters von Dehalococcoides und eines Bakteriums der Cytophaga-Flavobacterium-Bacteroides-Gruppe. Mit einer anderen Methode, der Analyse von Einzelstrang-Polymorphismen (SSCP), wurde die zusätzliche Anreicherung eines Bakteriums mit Ähnlichkeit zu Trichlorobacter thiogenes nachgewiesen.

Dioxin-dehalogenating cultures of anaerobic bacteria were established by successive transfers of laboratory microcosms that were initially prepared with contaminated sediment from the creek Spittelwasser site, Germany. The samples have been obtained from different depths of the sediment and were highly polluted with polychlorinated dibenzo-p-dioxins and -furans (PCDD/F) and other organohalogen compounds. The enrichment cultures were able to reductively dehalogenate the spiked model compounds 1,2,3,4-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (1,2,3,4-TeCDD), 1,2,3-trichlorodibenzo-p-dioxin (1,2,3-TrCDD), and 1,2,4-trichlorodibenzo-p-dioxin (1,2,4-TrCDD). Different dechlorination pathways were elucidated that exhibited different dechlorination endpoints and variable ratios of the major products 1,3- and 2,3-dichlorodibenzo-p-dioxin (DiCDD). Reductive dechlorination of spiked model compounds occurred also with sediment material from low contaminated sites. The results of a ribosomal DNA-based molecular survey (nested PCR) confirmed the presence of potential dechlorinating populations including Desulfitobacterium and Dehalococcoides, which were present in all cultures. The amplified Dehalococcoides 16S rDNA fragment was identical to the sequence of strain CBDB1. This bacterium was tested for its ability to dechlorinate dioxins and could transform 1,2,3,4-TeCDD, 1,2,3-TrCDD, 1,2,4-TrCDD, and 2,3-DiCDD to dechlorination products with 2-monochlorodibenzo-p-dioxin as tentative end product. In addition, the environmentally relevant congener 1,2,3,7,8-pentachlorodibenzo-p-dioxin was transformed to 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin and other lesser chlorinated congeners including 2,7- or 2,8-dichlorodibenzo-p-dioxin. Another study with the enrichment cultures showed that 1,2,3-trichlorobenzene, which was supplied using a two-phase system with hexadecane, was dechlorinated to 1,3-dichlorobenzene. After chlorobenzene dechlorination, the number of dioxin dechlorination was increased by three orders of magnitude. Molecular biological techniques have been applied in order to identify the key microbes. Restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis of 16S rDNA libraries revealed the enrichment of ten different restriction patterns including a Dehalococcoides-like organism and a bacterium of the Cytophaga-Flavobacterium-Bacteroides group. Another method, single-strand conformation polymorphism analysis, showed the additional enrichment of a bacterium similar to Trichlorobacter thiogenes.

Keywords:
reduktive Dechlorierung, reduktive Dehalogenierung, PCDD, Dioxine, Dibenzo-p-dioxin, Chlorbenzole

reductive dechlorination, reductive dehalogenation, PCDD, dioxins, dibenzo-p-dioxin, chlorobenzenes

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Inhaltsverzeichnis
Titelblatt, Inhalt
Zusammenfassung (1-4)
Kapitel 1 - Einführung (5-42)
Kapitel 2 - Regiospecific Dechlorination of Spiked Tetra- and Trichlorodibenzo-p-dioxins by Anaerobic Bacteria from PCDD/F-Contaminated Spittelwasser Sediments (43-56)
Kapitel 3 - Anaerobic Transformation of Dioxins by Bacteria from River Sediments: Diversity of the Dehalogenating Community (57-78)
Kapitel 4 - Reductive Dehalogenation of Chlorinated Dioxins by an Anaerobic Bacterium (79-94)
Kapitel 5 - Enrichment of Dioxin-Dehalogenating Bacteria by a Two-Liquid-Phase System with 1,2,3-Trichlorobenzene (95-126)
Kapitel 6 - Studying the Microbial Dynamics of a Trichlorobenzene-Dechlorinating Community by Single-Strand Conformation Polymorphism (127-140)