Georg Berndt

Antioxidative Wirkungen NO-freisetzender NSAIDs in endothelialen und gastralen Zellen: Hämoxygenase-1 als möglicher Mediator

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt an der Mathematisch-Naturwissenschaftlich-Technischen Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 05.05.2004

Abstract
NO-NSAIDs sind konventionelle NSAIDs, die eine Stickstoffmonoxid(NO)-freisetzende Gruppe tragen. Die NO-Freisetzung konnte in LLC-PK-1-Zellen durch Bestimmung des intrazellulären cGMP-Spiegels gezeigt werden. Am Beispiel des NO-Naproxens stimulierten NO-NSAIDs konzentrationsabhängig die cGMP-Bildung. Kontrollversuche mit Naproxen und Vorbehandlung der Zellen mit SOD oder Hämoglobin belegen, dass der Effekt dem freigesetzten NO-Radikal zuzuschreiben ist. Eine Vorinkubation mit GTN oder NO-Naproxen führte zur Downregulation der NO-Freisetzung aus beiden Verbindungen. Diese Kreuzempfindlichkeit belegt, dass organische Nitrate und NO-NSAIDs über gemeinsame Stoffwechselwege bioaktiviert werden. Besondere Aufmerksamkeit galt der NO-abhängigen Induktion antioxidativer Proteine am Beispiel der HO-1. In Endothelzellen induzierten NO-NSAIDs die HO-1 sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene konzentrations- und zeitabhängig. Die NO-freien Muttersubstanzen zeigten ebenso wie der selektive COX-2-Hemmer Rofecoxib keinen induktiven Effekt auf die HO-1. Darüber hinaus wurde erstmalig eine NO-abhängige Induktion der HO-1 in gastralen Epithelzellen nachgewiesen. Inwieweit sich die genomischen Effekte von NO-NSAIDs funktionell als antioxidative Schutzwirkung manifestieren, wurde in einem Zellkulturmodell für oxidativen Stress untersucht. In Endothelzellen und gastralen Epithelzellen zeigten NO-NSAIDs sowohl direkte als auch indirekte antioxidative Wirkungen. Im gleichen Modell zeigte der HO-1-Metabolit Bilirubin konzentrationsabhängige antioxidative Effekte. Dieses Ergebnis dokumentiert, dass HO-1-Metabolite unter den gewählten Bedingungen als Mediatoren der NO-NSAID-Effekte fungieren können. Mit Hilfe eines Hämoxygenase-Inhibitors konnte schließlich ein kausaler Zusammenhang zwischen der HO-1-Induktion durch NO-NSAIDs und deren indirekten antioxidativen Wirkungen festgestellt werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit charakterisieren die NO-NSAIDs als potente Aktivatoren antioxidativer und antiinflammatorischer Stoffwechselwege. Die Induktion der HO-1 durch NO-NSAIDs ist ein hier erstmalig beschriebener Wirkmechanismus, der ursächlich an protektiven Effekten der NO-NSAIDs in der Magenschleimhaut, der Niere und im kardiovaskulären System beteiligt sein könnte.

Nitric oxide-releasing nonsteroidal anti-inflammatory drugs (NO-NSAIDs) donate nitric oxide in biological systems through as yet unidentified mechanisms. cGMP, a marker of intracellularly generated NO, was increased by NO-naproxen in LLC-PK-1 cells. The increase in cGMP is fully attributable to the release of NO because it is diminished by incubation of cells with the NO scavenger hemoglobin and enhanced by superoxide dismutase, which is known to stabilize the short-lived nitric oxide free radical. Pretreatment with either glyceryl trinitrate (GTN) or NO-naproxen attenutes the cGMP response to both agents, which demonstrates that NO-NSAIDs are bioactivated through pathways that are also responsible for NO formation from nitric acid esters such as GTN.
Incubation of human endothelial cells with different NO-NSAIDs led to increased expression of heme oxygenase(HO)-1 mRNA and protein. In contrast, the NO-free parent compounds and rofecoxib, an inhibitor of COX-2 left HO-1 expression unaltered. Pretreating endothelial cells with NO-NSAIDs at concentrations that were also effective in HO-1 induction reduced NADPH-dependent production of oxygen radicals. Antioxidant activity in endothelial cells persisted after NO-NSAIDs have been removed from the incubation medium. The HO-1 metabolite bilirubin, when added exogenously to the cells at low micromolar concentrations virtually abolished NADPH-dependent oxidative stress. NO-NSAID-induced blockade of free radical formation was rescued in the presence of the HO inhibitor, SnPP. Similar results were obtained in human gastric mucosal cells. The results demonstrate that HO-1 is a novel target of NO-NSAIDs and mediates antioxidant actions of these compounds in vascular and gastric tissue.

Keywords:
Nichtsteroidale Antiphlogistika, NO-NSAIDs, Stickstoffmonoxid, Endothel, Magenschleimhaut, COX-Hemmer, Hämoxygenase-1

NO-NSAIDs, nitric oxide, endothelium, gastric mucosa, nonsteroidal anti-inflammatory drugs, COX-2

Abbreviations: GTN, glyceryl trinitrate; HO, heme oxygenase; NO, nitric oxide; NO-NSAIDs, NO-releasing non-steroidal anti-inflammatory drug; NSAID, non-steroidal anti-inflammatory drug; COX, cyclooxygenase

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Inhaltsverzeichnis
Titelblatt, Inhaltsverzeichnis, Abkürzungsverzeichnis (2, 1-6)
1 Einleitung (7-23)
2 Problemstellung (24-25)
3 Methoden und Material (26-38)
4 Ergebnisse (39-67)
5 Diskussion (68-81)
6 Zusammenfassung (82-83)
7 Literaturverzeichnis (84-97)
8 Veröffentlichungen (98)