Sven Gottwald

Genetische und physische Feinkartierung im Bereich des gai Verzwergungsgens auf dem Chromosom 2HS der Gerste (Hordeum vulgare L.)

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor agriculturarum (Dr. agr.) vorgelegt an der Landwirtschaftlichen Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 02.02.2004

Abstract
Die züchterische Nutzung von Getreidezwergmutanten spielte eine bedeutende Rolle während der 'Grünen Revolution' zwischen 1960 und 1970, da diese Mutanten die Entwicklung von Hochertragssorten mit einem erhöhten Harvest-Index ermöglichten. Häufige Ursache für einen Zwergphänotyp ist ein mutiertes Gen der Gibberellinsäure (GA)-Biosynthese (GA-sensitive Mutante) oder der GA-Signaltransduktion (GA-insensitive Mutante).
Ziel der vorliegenden Arbeit war die hochauflösenden Kartierung und Markerabsättigung der genetischen Region um das GA-insensitive Verzwergungsgen gai auf dem Gerstenchromosom 2HS, als Voraussetzung für die kartengestützte Klonierung.
Gestützt auf Beobachtungen aus früheren Studien über konservierte Markeranordnungen und über orthologe Beziehungen GA-insensitiver Gene zwischen unterschiedlichen Gräsergenomen im allgemeinen und zwischen den Genomen von Gerste und Reis im besonderen, wurde eine syntäniebasierte Strategie gewählt. Durch einen Vergleich genetischer Gersten- und Reiskarten konnte eine syntäne Region des Reischromosoms 7L theoretisch identifiziert und durch die Integration von sieben Reismarkern in die genetische Gerstenkarte verifiziert werden. Basierend auf der beobachteten Colinearität zwischen beiden genetischen Regionen wurden korrespondierende Reis-Contigs in den genetisch integrierten YAC- und BAC- / PAC-Karten identifiziert. Über das YAC-Contig wurden drei zusätzliche Marker für die gai Region verfügbar, von denen zwei Marker in der Gerste das genetische Zielintervall (0,55 cM) und im Reis, durch elektronisches 'chromosome walking', die vier BAC-Klone (~ 224 kb) umfassende physische Zielregion definieren. Deren Sequenzstrukturdaten (RiceGAAS) offenbarten drei putative Signaltransduktions-ORFs (SORF I, II und III). Zwei dieser Reis-ORFs (SORF I und III) konnten mittels homologer Weizen- und Gersten-ESTs in der Gerste, gai unmittelbar flankierend, kartiert werden. Der dritte ORF (SORF II) könnte auf Grund seiner physischen Position zwischen SORF I und III als möglicher gai Kandidat für die kartengestützte Isolierung des Gens aus der Gerste fungieren.
Die vorliegende, hochauflösende und vergleichende Studie zwischen Gerste und Reis für die gai Region zeigt eine stabile orthologe Beziehung, basierend auf der Integration von 10 Reis-EST-Markern aus der genetischen und von zwei putativen Reisgenen ('SHR-like' und 'GA-regulated') aus der physischen Zielregion im Reis.

Cereal genotypes exhibiting a dwarfed phenotype played an important role during the 'green revolution' between 1960 and 1970, when the exploitation of dwarfing mutants allowed for the development of high yielding cultivars with an improved harvest index. In a number of cases the functional basis of dwarfing phenotypes is due to a mutation in a gene of the gibberellic-acid (GA) biosynthesis pathway (GA-sensitive mutant) or of the GA signal transduction (GA-insensitive mutant).
The emphasis of the present work was to develop a high resolution map and to achieve marker saturation of the gai region, as a precondition for the map-based cloning of this gene.
Based on observations from previous studies regarding conservation of marker orders and orthologous relationships between GA-insensitive genes across grass genomes generally and between the genomes of barley and rice in particular, a synteny-based strategy was chosen. Comparing the barley and rice genetic linkage maps, it was possible to identify theoretically a syntenic region of rice chromosome 7L and finally, to confirm this synteny by integrating seven rice markers into the barley genetic map. Based on the observed colinearity between both genetic regions a corresponding rice contig was identified in the available YAC and BAC / PAC maps. The analysis of the defined YAC contig led to the detection of three new YAC originated rice markers for the gai region. Out of these, two markers could define the final target interval (0,55 cM) in barley, and by electronic chromosome walking the physical target region (~ 224 kb) consisting of four rice BAC clones. Three putative open reading frames (SORF I - III) were identified in the rice sequence data (RiceGAAS) exhibiting significant sequence similarity to known signal transduction genes. By using sequence homologous wheat and barley ESTs, two of these rice-ORFs (SORF I and III) could be mapped in barley, flanking the gai Locus directly. Based on its physical position between SORF I and III, the third rice-ORF (SORF II) could be the supposed gai candidate and might serve as a starting point for the map-based isolation of the gene in barley.
The present, comparative and high resolution study between barley and rice in the gai region revealed a stable orthologous relationship, based on the integration of 10 rice EST markers of the genetic and two putative rice genes ('SHR-like' und 'GA-regulated') of the physical rice target region.

Keywords:
Gerste, Hordeum vulgare, Reis, Oryza sativa, EST, Syntänie, vergleichende Kartierung, Gibberellin, GA-Insensitivität, Signaltransduktion

barley, Hordeum vulgare, rice, Oryza sativa, EST, synteny, comparative mapping, gibberellin, GA-insensitivity, signal transduction

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Inhaltsverzeichnis
Titelblatt, Inhalts-, Tabellen-, Abbildungs-, Abkürzungsverzeichnis (1, I-VII)
1 Einleitung (1-2)
2 Literaturübersicht (3-45)
3 Material und Methoden (46-67)
4 Ergebnisse (68-97)
5 Diskussion (98-122)
6 Zusammenfassung / Summary (123-126)
7 Literaturverzeichnis (127-151)
8 Anhang (152-165)
Publikationen, Poster