Ingo Hofmann

Erzeugung, Isolation und Charakterisierung von Suppressormutanten für Transcriptional Gene Silencing in Arabidopsis thaliana

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt an der Mathematisch-Naturwissenschaftlich-Technischen Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 03.11.2004

Abstract
In eukariotischen Organismen werden Prozesse der Entwicklung und Differenzierung u.a. epigenetisch durch Veränderungen der Chromatinstruktur kontrolliert. Veränderungen im Verpackungsgrad von Chromatindomänen führen zur Aktivierung oder Inaktivierung einzelner Gene in solchen Domänen. Zahlreiche Untersuchungen haben gezeigt, daß auch verschiedene Phänomene homologieabhängiger transkriptioneller Transgeninaktivierung in transgenen Pflanzen die Folge von Veränderungen der Chromatinstruktur sind. Die Isolation von Mutanten, die solche Silencing-Prozesse beeinflussen, sollten zur Identifizierung von Proteinen führen, die an der Etablierung und Regulation epigenetischer Strukturen beteiligt sind. Entsprechend dieser Hypothese war das Ziel dieser Arbeit die Isolation und Charakterisierung neuer Suppressormutanten für Transcriptional Gene Silencing (TGS). In Ermangelung sensitiver und einfach handhabbarer Testsysteme für TGS in Pflanzen wurde in Arabidopsis thaliana zunächst ein neues Silencing-Testsystem auf der Basis transkriptionell inaktivierter transgener Reportergene (GUS, Luciferase) etabliert. Dazu wurden Arabidopsis-T-DNA-Linien hergestellt, die auf einer T-DNA ein bis vier Kopien eines der verwendeten Reportergene unter der Kontrolle des CaMV-35S-Promotors tragen. Mit Hilfe vollständig inaktivierter Luciferaselinien wurde in einem EMS-Mutageneseexperiment nach TGS-Suppressormutanten gesucht. 50000 M2-Nachkommen aus 50 unabhängigen Pools wurden auf reaktivierte Luciferaseexpression untersucht und 159 putative Mutanten isoliert. Bei 9 von 19 näher untersuchten Mutanten ist die DNA-Methylierung der Luciferasegene im Vergleich zu nicht mutagenisierten Kontrollpflanzen erheblich verringert. Durch Kartierungsexperimente mit 15 Mutantenlinien konnten 8 verschiedene Loci als wahrscheinliche Mutationsorte identifiziert werden. Die Kartierungsdaten der 9 Mutantenlinien mit charakteristischen Veränderungen der DNA-Methylierung lassen vermuten, daß diese Mutanten allel zu den bereits bekannten Silencing-Mutanten ddm1, met1 bzw. cmt3 sind. Die Mutationsorte von drei weitere Mutanten ohne veränderte DNA-Methylierung wurden durch Feinkartierung eingegrenzt und molekular charakterisiert. Zwei dieser Mutanten zeigen eine gewebespezifische TGS-Suppression als Folge von Punktmutationen im TTG2-Locus. Die dritte neue Mutante, bru1-2, wurde in Kooperation mit weiteren Gruppen charakterisiert.

In eukaryotic organisms, processes of development and differentiation are epigentically controlled at the level of higher order chromatin structure. Changes in packaging of chromatin domains lead to activation or repression of single genes within such domains. Numerous studies have shown that several phenomena of homology dependent transcriptional gene silencing in transgenic plants are also the consequence of chromatin remodelling. Isolation of mutants affecting such silencing processes should lead to the identification of proteins involved in establishment and regulation of epigenetic structures. According to this hypothesis, the aim of this work was the isolation and characterisation of new suppressor mutants for transcriptional gene silencing (TGS). Due to the lack of sensitive and facile test systems for TGS in plants, a new silencing system based on transcriptionaly silenced transgenic reporter genes (GUS, Luciferase) was established. For this purpose, Arabidopsis-T-DNA lines have been constructed containing one to four copies of the same reporter gene driven by the CaMV 35S promotor. To isolate suppressor mutants for TGS, EMS mutagenesis using completly inactivated luciferase lines has been carried out. 50,000 M2 plants raised from 50 independent pools were screened for increased luciferase activity and 159 putative mutants were isolated. In 9 of 19 further characterised mutants, the DNA methylation of the luciferase genes is largely reduced compared to non-mutagenised control plants. Mapping experiments on 15 mutant lines allow to limit 8 different loci as putative mutation sites. The mapping data of 9 lines with characteristic changes in DNA methylation suggest that these mutants are allelic to the known silencing mutants ddm1, met1 and cmt3. The mutation sites of three other mutants without changes in DNA methylation were discovered by map based cloning. Two of these mutants showing tissue specific TGS suppression were point mutations in TTG2. Bru1-2, the third new mutant, was characterised in collaboration with other groups.

Keywords:
Arabidopsis thaliana, Luciferase, transkriptionelle Geninaktivierung, TGS, Heterochromatin, DNA-Methylierung, BRU1, TTG2

Arabidopsis thaliana, luciferase, transcriptional gene silencing, TGS, heterochromatin, DNA methylation, BRU1, TTG2

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Inhaltsverzeichnis
Titelblatt, Inhaltsverzeichnis, Abkürzungsverzeichnis
1 Einleitung (1-13)
2 Material und Methoden (14-26)
3 Ergebnisse (27-62)
4 Diskussion (63-81)
5 Zusammenfassung (82-83)
6 Literatur (84-95)
7 Anhang (96-102)