Lars Waldmann

Effect of L-arginine and guanidinium chloride (GdmCl) on the unfolding and refolding of hen egg-white lysozyme (HEWL)

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt an der Mathematisch-Naturwissenschaftlich-Technischen Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 18.03.2005

Abstract
L-Arginin ist ein Faltungsadditiv, das häufig eingesetzt wird, um die Effizienz von Proteinfaltungsprozessen zu erhöhen. Die Anwendung wurde zum ersten Mal in einer Patentveröffentlichung im Jahr 1985 beschrieben. Es zeigte sich, daß Arginin sehr für eine Vielzahl von Proteinen sehr wirksam ist, aber der zugrundelegende Wirkungsmechanismus wurde noch nicht bestimmt. Das Ziel dieser Arbeit war daher, den zugrundeliegenden Wirkungsmechanismus von Arginin zu ermitteln.
Für die Versuche wurde Hühnereiweißlysozym als Modellprotein verwendet, für das während der Rückfaltung eine Konkurrenzreaktion zwischen Rückfaltung und Aggregation auftritt. In dieser Arbeit wurde die Wirkung von Arginin im Konzentrationsbereich 0-2 M zu Guanidinhydrochlorid (GdmCl) verglichen, das ebenso wie Arginin eine Guanidingruppe besitzt.
Bei Zimmertemperatur üben beide Faltungsadditive auf die Sekundär- und Tertiärstruktur keinen Einfluß aus. In Gegenwart von GdmCl verringert sich die Temperaturstabilität von Lysozym, wohingegen Areginin nicht die Stabilität beeinflußt. Es wurden Temperaturübergangsmessungen in Gegenwart von Sulfhydrylverbindungen durchgeführt, die während des Rückfaltungsprozesses zugegeben werden müssen, um die Ausbildung der korrekten Disulfidbrücken während der Rückfaltung zu ermöglichen. Diese Verbindungen wurden zugesetzt, um den Proteinzustand während der Ruckfaltung zu simulieren. Während der Rückfaltung ist, ähnlich wie bei der Entfaltung, das Protein teilentfaltet, und die Sulfhydrylgruppen sind dem Lösungsmittel zugänglich. Unter diesen Bedingungen stabilisiert Arginin das Protein, was darauf hindeutet, daß es möglicherweise Faltungsintermediate stabilisiert. Es wurde gezeigt, daß beide Additive die Löslichkeit von denaturiertem Protein erhöhen, wohingegen das Auflösen von Aggregaten keine bedeutende Rolle spielt für die Faltungseffizienz beider Additive. Kinetische Konstanten für die Faltung und Aggregation wurden von Daten abgeleitet. Es zeigte sich, daß beide Additive die Aggregationsraten in ähnlicher Art und Weise beeinflußen. Die Faltungsraten ware leicht erhöht in Gegenwart von Arginin. ANS Fluoreszenzkinetiken wurden gemessen, die zeigten, daß sich Faltungsintermediate in Gegenwart von Additiven langsamer ausbilden. Wenn Arginin zu einem bereits laufenden Faltungsprozeß zugegeben wurden, zeigte sich, daß es von Anfang an anwesend sein. Dies wiederum zeigt, daß Arginin mit Faltungsintermediaten wechselwirken muß, um Aggregation zu unterdrücken.
Ein neuartiger, reduktiver Aggregationsprozeß von Lysozym wurde beschrieben. Wenn Dithiothreitol (DTT) zu nativem Lysozym zugegeben wird, wurden Aggregate nach einer Verzögerungsphase beobachtet. Arginin und GdmCl können beide die Aggregation verringern. Der Aggregation vorausgehend wurde ein Verlust der enzymatischen Aktivität beobachtet, die durch Reduktion der Disulfidbrücken hervorgerufen wird. Ein Vergleich der Aktivitäts-, Aggregations- und ANS-Kinetiken zeigt, daß GdmCl Aggregation zu unterbinden scheint durch Erhöhung der Löslichkeit von Intermediaten und Aggregaten, wohingegen Arginin die Löslichkeit der Intermediate erhöht, und somit Aggregation verringert.

L-arginine hydrochloride is an additive which is frequently used to increase yields of protein folding processes. It was first described in a patent publication in 1985. While arginine proved to be an efficient folding additive for a large number of proteins, the underlying mechanism has never been elucidated. The scope of this work was to identify the underlying mechanism.
For the experiments hen egg-white lysozyme was used as model protein, which is subject to a competition between folding and aggregation when denatured-reduced. The effects of arginine in the concentration range 0-2 M were compared to guanidinium hydrochloride (GdmCl), which contains a guanidinium group.
At room temperature, both additives do not affect secondary and tertiary structure. In presence of GdmCl the temperature stability of lysozyme declines, while arginine does not affect the stability. Temperature transitions were also recorded in presence of thiol components, which are required for correct formation of disulfide bonds during refolding. Those chemicals were added to simulate the influence during protein refolding, since during the refolding the protein is partially folded and thiol groups are accessible to the solvent. Under these conditions, arginine stabilizes the protein, indicating that it may stabilize folding intermediates. It was shown that both additives increase solubility of denatured protein, while dissolution of large aggregates in the concentration range 0-1 M does not play a significant role. Kinetic constants for folding and aggregation were derived, indicating that both additives decrease aggregation rates in a similar way. Folding rates were slightly elevated in presence of arginine. ANS fluorescence kinetics were monitored which indicate that the formation of intermediates occurs slower in presence of additives than in the absence. When arginine is added to an on-going refolding process it became apparent that it needs to be present from the beginning on, indicating that it must interact with folding intermediates.
A novel, reductive aggregation process for lysozyme was described. When dithiothreitrol (DTT) is added to native lysozyme, after a lag phase aggregation was observed. Arginine and GdmCl are both efficient suppressors of this aggregation pathway. Preceding aggregation, a loss of enzymatic activity was observed, which is mediated by reduction of disulfide bonds. When kinetics of activity, aggregation, and ANS fluorescence were superimposed, it became apparent that GdmCl appears to suppress aggregation by increasing solubility of intermediates and aggregates, while arginine increases solubility of intermediate states, thus decreasing the susceptibility of aggregation.

Keywords:
L-Arginin, Guanidinhydrochlorid (GdmCl), Lysozym, Proteinfaltung, Faltungsintermediate, reduktive Entfaltung, Löslichkeit, Disulfidbrücken, Proteinfaltungsadditiv

L-arginine, guanidinium hydrochloride (GdmCl), lysozyme, protein folding, folding intermediates, reductive unfolding, solubility, disulfide bonds, protein folding additive

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Inhaltsverzeichnis
Title page, Zusammenfassung, Table of contents (2, I-VI, 1)
1. Introduction (1-22)
2. Materials and Methods (23-30)
3. Results (31-104)
4. Summary and future work (105-112)
5. References (113-120)
Appendix (121-123)