Michael Geisler

Untersuchung der Regulation der Promotoraktivität von Aminopeptidase N (APN) in hämatopoietischen Zellen

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades Doktor der Medizin (Dr. med.) vorgelegt an der Medizinischen Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 12.01.2005

Abstract
Aminopeptidase N (APN)/CD13, eine membranassoziierte Metalloprotease, besitzt Funktionen bei der Verdauung, Rückgewinnung renal filtrierter Proteine und Modulation von Kininen und Neuropeptiden. Immunologische Bedeutung besteht u.a. als Rezeptor für Viren im Respirationstrakt, beim Antigen-Prozessing auf der Oberfläche antigenpräsentierender Zellen (APC), bei Adhäsionsprozessen, der zellulären Interaktion mittels Zell-Zell-Kontakt, sowie bei der Progression maligner Tumoren.
Es erfolgten Untersuchungen zur Aktivität des distalen Promotors und des Enhancers der APN an immortalisierten lymphatischen und myeloischen Zelllinien mittels Lipotransfektion von Plasmidkonstrukten, anschließender Stimulation mittels Phorbolesther oder TGF-1 und Dual-LuciferaseTM Reportergen Assay.
Eine Promotoraktivierung über die cis-Elemente für c-MYB, DMP-1 und c-ETS wurde in myeloischen Zellen nachgewiesen, die Ergebnisse in lymphatischen Zellen sprechen gegen eine Bedeutung dieser Bindestellen, weiterhin zeigen sich Differenzen bezüglich der Kinetik der Aktivierung. Ein weiteres für die Expression in myeloischen Zellen bedeutsames, bisher nicht näher identifiziertes cis-Element existiert bei -48bp.
TGF- besitzt einen positiv regulierenden Einfluss auf den myeloischen APN-Promotor in myeloischen Zellinien. Durch Überexpression eines der Proteine des TGF--Signalweges Smad3 oder Smad4 kommt es zu einer erhöhten Ansprechbarkeit auf TGF-. Bei Überexpression beider Konstrukte zeigt sich eine Suppression. Ein "Squelching"-Phänomen durch intranukleären Überschuss an Smad3/Smad4-Heterodimeren, eine Aktivierung inhibierender DNA-Elemente bzw. Transkriptionsfaktoren (z.B. Smad7) kann diskutiert werden.

Aminopeptidase N (APN/CD13) is a membrane associated zinc protease with important functions in digestion, reresorbtion of renal filtrated proteins and modulation of kinins and neuropeptides. Immunologically it is important as a receptor for different viruses affecting intestinum and respiratory tract, in the antigen processing at the surface of antigen-presenting cells (APC), processes of adhesion, cellular interaction and in the progression of malignant tumors.
In this paper I made examinations of the activity of the distal promoter and the enhancer of APN in lymphatic and myeloic cell lines trough lipotransfection of promoter constructs and following stimulation with phorbolester or TGF- and the Dual-Luciferase Reporter Assay System.
The activating properties of different promoter elements used by c-MYB, c-ETS and DMP-1 can be shown in myeloic cells, the results in lymphatic cells are different and show that this elements are not used in lymphatic cell lines. Furthermore there is a difference in the kinetic of the activation. Another promoter element important for the expression of myeloic cells can be identified at -48 bp.
TGF- shows a positive regulating effect on the myeloic promoter in myeloic cell lines. Overexpression of smad3 or smad4, signalling proteins of the TGF- signal pathway leads to a higher activating effect of TGF-. Overexpression of both proteins show a suppressive effect. A squelching effect trough a intranuclear surplus of smad complexes, an activation of inhibiting promoter elements or transcription factors (e.g. smad7) can be possible explanations.

Keywords:
Aminopeptidase N (APN) /CD13, TGF-, myeloischer Promotor, Smad, Enhancer, squelching

Aminopeptidase N (APN) /CD13, TGF-, myeloic promoter, Smad, enhancer, squelching

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Inhaltsverzeichnis
Titelblatt, Referat, Inhaltsverzeichnis, Abkürzungsverzeichnis
1. Einleitung (1-10)
2. Materialien und Methoden (10-20)
3. Ergebnisse (21-31)
4. Diskussion (32-43)
Literaturverzeichnis (44-54)
Thesen (55-57)