Matthias Kappler

Molekulare Charakterisierung des IAP Survivin in Weichteilsarkomen: Bedeutung für Prognose und Etablierung neuer Therapiestrategien

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt an der Mathematisch-Naturwissenschaftlich-Technischen Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 09.03.2005

Abstract
In der vorliegenden Arbeit wurden Weichteilsarkome (WTS), eine Gruppe maligner Tumoren, molekulargenetisch untersucht. Neue molekulare Prognosefaktoren könnten für eine bessere individuelle Behandlung von Tumorpatienten genutzt werden. Ein solcher Prognosefaktor ist möglicherweise Survivin, welches ein Bindeglied zwischen Apoptose und Zellzyklus darstellt. Um die prognostische Relevanz von Survivin zu bestimmen, wurde die Expression des Inhibitors der Apoptose - Survivin in Tumoren erkrankter Patienten analysiert. Diese Ergebnisse wurden zusammen mit den klinischen Daten der Patienten in einer multivariaten Cox-Regressionsanalyse ausgewertet. Eine erhöhte Gesamtsurvivin-mRNA-Expression konnte als ein negativer und unabhängiger Prognosemarker für die untersuchten 94 WTS-Patienten identifiziert werden (RR=2,7; p=0,009). Die Proteinexpression von Survivin, mittels Westernblot-Analyse bzw. ELISA an 63 WTS-Patientenproben, identifizierte auch die Überexpression des Survivinproteins als einen negativen und unabhängigen Prognosemarker für WTS (WB: RR=5,1; p=0,004; ELISA: RR= 19,8; p=0,001). Wenn Survivin auf mRNA- oder Proteinniveau in WTS verstärkt exprimiert wird, korreliert dies mit einem erhöhten Sterberisiko. Wird die mRNA-Expression der humanen Telomerase reversen Transkriptase (hTERT) mit der Survivin-mRNA-Expression kombiniert, zeigen sich in der Cox-Regressionsanalyse superadditive Effekte in Bezug auf das Sterberisiko. Patienten, deren Tumoren hTERT- und Survivin-mRNA in hohen Konzentrationen exprimieren, weisen im Vergleich zu Patienten deren Tumoren diese Gene nicht überexprimieren, ein 20-fach erhöhtes Risiko auf, an einem WTS zu versterben. Diese Daten dokumentieren die Bedeutung von Survivin als molekularen Prognosefaktor, welcher durch eine unregulierte Überexpression die Tumorprogression fördert. Mittels siRNA-spezifischer Inhibierung der Survivinexpression wurde versucht einen therapeutischen Ansatz zur Schädigung der Tumorzellen zu finden. Fünf humanen Sarkomzelllinien (A 204, US 8-93, SK-LMS, RD, Saos 2), mit unterschiedlichem p53-Genstatus, wurden mit Survivin-spezifischen-siRNA behandelt. 24 h nach Behandlungsbeginn konnte die Survivin-mRNA um 73-88% und das Survivinprotein um 52-81 %, im Vergleich zu den mit Kontroll-siRNA behandelten Zellen, verringert werden. Die Plattiereffizienz wurde um 65-86 % verringert. Diese Effekte waren damit unabhängig vom jeweiligen p53-Genstatus der behandelten Zelllinien. Die Apoptose stieg infolge der siRNA Behandlung nicht wesentlich an. Die Analyse des Zellzyklus der US 8-93 zeigte, dass die Zellen nach dem Survivin "knock down" in der G2/M Phase arretierten und nachfolgend polyploide Zellen generiert wurden. An zwei Zelllinien (mit wt-p53 bzw. mit mt-p53 Genstatus) erfolgte die Behandlung mit Survivin-spezifischen siRNA in Kombination mit Röntgenstrahlen. In der wt-p53 Zelllinie A-204 führt der Survivin "knock down" zu einer Strahlensensitivierung, d.h. die zellbiologische Wirkung der Bestrahlung wurde signifikant verstärkt. Der Verstärkungsfaktor nach einer Strahlendosis von 2 Gy lag bei 1,8 (p= 0,05) bzw. von 4 Gy bei 2,5 (p=0,02). Keine Radiosensitivierung wurde in der mt-p53 Zelllinie US 8-93 gefunden. Die Aktivität der mit Survivin assoziierten Kaspasen-3 und -7 war nur in der wt-p53 Zelllinie als Folge der Survivin-Inhibierung um das 5fache erhöht.

In this study, a group of malignant tumors, so-called soft tissue sarcomas (STS), were investigated with molecular biological methods. In order to develop tailor-made cancer treatments, new molecular prognosis factors must be identified. One of these new factors could be survivin the linker between apoptosis and cell cycle. The expression of the inhibitor of apoptosis survivin was analysed in STS. In a multivariate cox- regression analysis these data s were combined with the clinical parameters of cancer-patients. As results we found that high expression of survivin-mRNA is associated with a worse outcome of STS patients (RR=2.7; p=0.009). Similar results were found when the survivin protein expression was analysed by western blot hybridisation as well as by ELISA (WB: RR=5.1; p=0.004; ELISA: RR= 19.8; p=0.001). An overexpression of survivin on mRNA or protein level is associated with a worse outcome of STS patients. Moreover, when mRNA expression of survivin and telomerase reverse transcriptase (hTERT) was combined, additive effects for the outcome in the multivariate cox-regression analysis were identified. Co-overexpression of survivin and hTERT is correlated with a 20-fold increased risk of tumor-related death. These results show the high prognostic impact of survivin, which promotes tumor progression.
Furthermore, survivin-specific siRNA were used to damage cancer cells, as therapeutic treatment. Five human sarcoma cell lines (A 204, US 8-93, SK-LMS, RD, Saos 2) with different p53-gene status were treated with siRNA against survivin. Compared with survivin mRNA expression in the nonsense siRNA-treated sarcoma cell lines, expression after treatment with survivin-specific siRNA was reduced by 73-88%; survivin protein expression was reduced by 52-81%, 24 h after treatment. This finding was coupled with a reduction in clonogenic survival ranging from 65-86%. These effects were occurred regardless of the presence of wild-type p53 alleles. However, apoptosis was not increased after treatment with survivin-specific siRNA. Cell cycle and morphologic analyses of the cell line US 8-93 showed that after a dramatic increase in the number of treated cells in the G2/M phase, some of the cells became polyploidy. The effects of a combined treatment with siRNA and irradiation were investigated in two sarcoma cell lines with different p53-gene status. Survivin knock down caused radiosensitization in the cell line A-204 (wt-p53) with an enhancement factor of 1.8 at 2 Gy (p=0.05) and 2.5 at 4 Gy (p=0.02), respectively. No radiosensitization was found in the cell line US 8-93 (mt-p53). These findings were supported by an increase in activity (up to 5.2-fold) of caspases-3 and -7 only in cell line A-204 (wt-p53).
In summary, we found that an increased survivin expression is associated with worse outcome of STS patients. The knock down of survivin resulted in a disruption of mitosis in all treated cells, but for radiosensitization the p53-caspase-9 pathway is of importance.

Keywords:
Survivin, Weichteilsarkome, Prognose, siRNA, Polyploidie, Radiosensitivierung, Apoptose, p53-Genstatus, Röntgenstrahlen, Cox-Regressionsanalyse

survivin, soft tissue sarcoma, prognosis, siRNA, polyploidy, radiosensitization, apoptosis, p53-gene status, x-ray. Cox-regression analysis

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Inhaltsverzeichnis
Titelblatt, Abkürzungen, Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung (1-16)
2 Material (17-23)
3 Methoden (24-36)
4 Ergebnisse (37-63)
5 Diskussion (64-83)
6 Zusammenfassung (84-86)
7 Literatur (87-102)
8 Anhang (103-111)
Thesen