Constanze Günther

Untersuchungen zum funktionellen Gentransfer zelltypspezifischer, virusanaloger Partikel

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt an der Mathematisch-Naturwissenschaftlich-Technischen Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 05.10.2005

Abstract
Die zelltypspezifische Adressierung von Transportsystemen ist ein wichtiger Aspekt für die Entwicklung von therapeutischen Ansätzen. Das in dieser Arbeit entwickelte Transportsystem basiert auf virusanalogen Partikeln, die aus dem Hüllprotein VP1 des murinen Polyomavirus zusammengesetzt sind. Durch Insertion von 8 Glutaminsäuren und einem Cystein in den HI-loop von VP1 steht ein universeller Adapter an der Oberfläche der Partikel zur Kopplung von Liganden, die komplementär geladene Peptide enthalten, zur Verfügung. Die zelltypspezifische Aufnahme der Partikel wurde durch gerichtete Kopplung des Fv-Fragments des B3-Antikörpers erreicht. Trotz der effizienten Aufnahme der Partikel in Lewis Y-positive Zellen wurden nur Transfektionsraten von unter 0.1 % mittels dieser Partikel erreicht. Als Limitation für den funktionellen Transfer wurde der lysosomale Abbau der Partikel und der damit transportierten Plasmid-DNA nach rezeptorvermittelter Endozytose identifiziert. Die zusätzliche Kopplung von Listeriolysin O (LLO) an die virusanalogen Partikel resultierte in einer signifikanten Steigerung der Transfektionsrate auf bis zu 2.5 %.
In dieser Arbeit wurde demonstriert, dass durch die parallele Kopplung eines Freisetzungsmoduls (LLO) der funktionelle Gentransfer der zelltypspezifischen, virusanalogen Partikel erheblich gesteigert werden konnte.

Celltype-specific targeting of delivery-sytems is one major aspect for the development of therapeutical approaches. The system used in this thesis is based on virus-like particles (VLP) that are derived from mouse polyomavirus major coat protein VP1. The insertion of a polyionic peptide consisting of 8 glutamic acids residues and one cystein into the HI-loop of VP1 provides a universal adapter on the surface of these particles to couple ligands containing complementary charged peptids. The celltype-specific uptake of the particles was achieved by coupling of the Fv-Fragment of the monoclonal antibody B3 via the polyionic adapter. Although the cellular uptake of the VLP into Lewis Y-positive target cells was very efficient the transfection rate using a reporter-plasmid was only below 0.1 %. Lysosmal degradation of the particles and the associated plasmid-DNA after receptor-mediated endocytosis was identified as the limiting step for functional gene transfer. The additional incorporation of listeriolysin O (LLO) into the VLP-system resulted in a significant increase of the transfection rate of up to 2.5 %.
In this work it was demonstrated that the parallel coupling of a targeting moiety (Fv-fragment) and a release module (LLO) to virus-like particles results in increased functional gene transfer in a celltype-specific manner.

Keywords:
Transportsystem, virusanaloge Partikel, VP1, Gentransfer, Zelltypspezifität, Transfektion, rezeptorvermittelte Endozytose, lysosomaler Abbau, Gentherapie

delivery-system, virus-like particles, VP1, gene transfer, cell-type specificity, transfection, receptor-mediated endocytosis, lysosomal degradation, gene therapy

Online-Dokument im PDF-Format (8.396 KB) mit integrierter Gliederung.

Inhaltsverzeichnis
Titelblatt, Inhaltsverzeichnis (1, I-IV)
1 Einleitung (1-26)
2 Material und Methoden (27-65)
3 Ergebnisse (66-125)
4 Diskussion (126-151)
5 Zusammenfassung und Ausblick (152-153)
6 Literaturverzeichnis (154-176)
7 Abkürzungen und englische Fachbegriffe (177-178)