Maria Hahn

Characterization of the epigenetical inactivation of the tumor suppressor gene RASSF1A in human mammary epithelial cells

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt an der Mathematisch-Naturwissenschaftlich-Technischen Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 10.10.2005

Abstract
Die epigenetische Inaktivierung des Tumorsuppressorgens RASSF1A wird häufig bei Krebs gefunden, jedoch sind die zugrunde liegenden Mechanismen der abberanten DNA-Methylation in den RASSF1A-CpG-Inseln unbekannt. In der vorliegenden Studie wurden vier Sp1-Bindungsstellen im RASSF1A-Promoter charakterisiert und die funktionelle Beziehung zwischen DNA-Methylation, Histon-Modifikation, Sp1-Bindung und RASSF1A-Expression in proliferierenden menschlichen Brustepithelzellen (HMEC) untersucht. Während der Proliferation war mit steigenden HMEC-Passagen die Transkription von RASSF1A dramatisch inaktiviert, was mit Deacetylierung und Lysin 9-Trimethylierung von Histon H3 und der Ausbreitung der DNA-Methylation von aufwärts und abwärts gelegen in den Promoter verbunden war. Die RASSF1A CpG-Insel in HMECs, die eine Stress-assoziierte Alterungsbarriere überwunden haben, war durch de novo DNA-Methylation und ein erhöhtes Niveau an trimethyliertem Histon H3 Lysin 9 charakterisiert. Die Bindung von Sp1 an den RASS1A-Promoter war in diesen Zellen beeinträchtigt. Die vorliegenden Daten weisen darauf hin, dass die Inaktivierung des Chromatins im gleichen Zeitfenster wie die Geninaktivierung auftritt und möglicherweise der de novo DNA-Methylation vorausgeht. Zusammengefasst wurden für den RASSF1A-Promoter während der Alterung der HMECs eine progressive Histon-Inaktivierung, eine Ausbreitung der DNA-Methylation und eine Inaktivierung der Sp1-Bindung beobachtet. Dadurch könnte dieses System als Modell für die epigenetische Inaktivierung des Tumorsuppressorgens bei der Karzinogenese dienen.

Epigenetical inactivation of the RASSF1A tumor suppressor gene was frequently detected in cancer. However, the mechanisms of aberrant DNA methylation in the RASSF1A CpG island are unknown. In the present study, four Sp1 sites in the RASSF1A promoter were characterized; and the functional relationship between DNA methylation, histone modification, Sp1 binding and RASSF1A expression was examined in proliferating human mammary epithelial cells. With increasing passages of HMECs, the transcription of RASSF1A was dramatically silenced and this was associated with deacetylation and lysine 9 trimethylation of histone H3 and spreading DNA methylation from upstream and downstream into promoter. The RASSF1A CpG island in HMECs, which had overcome a stress-associated senescence barrier, was characterized by de novo DNA methylation and an elevated level of trimethylated histone H3 lysine 9. The binding of Sp1 to the RASSF1A promoter was impaired in these cells. The present data suggest that the chromatin inactivation occurs in the same time window as gene inactivation and may precede the de novo DNA methylation. Moreover, present results indicate that the Sp1 binding is mediated by chromatin state and not by DNA methylation. In summary, progressive histone inactivation, spreading of DNA methylation and inactivation of the Sp1 binding were observed in the RASSF1A promoter during senescence of HMECs and this system may serve as a model for the epigenetical inactivation of the tumor suppressor gene in carcinogenesis.

Keywords:
Chromatin, DNA-Methylierung, RASSF1A, Promoter, Brustepithelzellen

chromatin, DNA methylation, RASSF1A, promoter, mammary epithelial cells

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Inhaltsverzeichnis
Title page, Contents, Abbreviations (1, I-VI)
1 Introduction (1-13)
2 Materials and methods (14-45)
3 Results (46-69)
4 Discussion (70-90)
5 Summary (91)
6 Literature (92-102)
7 Supplementary data (103-105)