Andreas Fischer

Funktionelle Charakterisierung neuer SET-Domänenproteine in Arabidopsis thaliana

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt an der Mathematisch-Naturwissenschaftlich-Technischen Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 26.09.2005

Abstract
In eukaryotischen Zellkernen ist die DNA an Histonproteine gebunden. Die resultierenden Nukleosomen sind durch Interaktion mit anderen Proteinen zu einer höheren Struktureinheit, dem Chromatin, konfiguriert. Die Kontrolle der transkriptionsaktiven und -inaktiven Bereiche im Chromatin erfolgt durch verschiedene Faktoren und epigenetische Prozesse. Die Modifizierung von DNA und Histonen kann eine lokale Veränderung der Chromatinstruktur bewirken. Diese epigenetischen Veränderungen der Chromatinstruktur können zu Gensilencing führen. Eine spezifische Rolle bei der Methylierung von Histonen spielen die Histon-Methyltransferasen (HMTasen). Eine gut charakterisierte HMTase für H3 Lysin 9 ist das SET-Domänenprotein SU(VAR)3-9, ein Suppressor für Positionseffekt-Variegation in Drosophila. Die SUVH-Proteine in Arabidopsis thaliana sind zum Drosophila SU(VAR)3-9 homolog. Die Funktion der meisten dieser 10 Mitglieder umfassenden Proteinfamilie ist noch unbekannt. Dementsprechend war das Ziel dieser Arbeit die Charakterisierung neuer SUVH Proteine aus Arabidopsis. Dazu wurde die Kernlokalisation sowie die Heterochromatin-Assoziation der Fusionsproteine in transienten Assaysystemen (Allium cepa und Scilla mischtschenkoana) analysiert. Zur Untersuchung der Funktion von SUVH1 und SUVH2 in Arabidopsis wurden transgene Pflanzenlinien hergestellt. In cytologischen Analysen wurden SUVH1 und SUVH2 sowie die beiden Chromatinproteine aus Drosophila, SU(VAR)3-9 und HP1, im Heterochromatin von Arabidopsis vorgefunden. Phänotypische Veränderungen der Wurzelhaare in SUVH1 Überexpressionslinien, Promoter-GUS- und RT-PCR-Analysen weisen auf eine Funktion von SUVH1 bei der Regulation der Wurzelentwicklung hin. SUVH2 zeigt in vitro und in vivo eine Histon-Methyltransferaseaktivität für H3 und H4. In Überexpressionslinien von SUVH2 kommt es zu drastischen phänotypischen Effekten, immunocytologisch konnte eine ektopische Verteilung des transgenen SUVH2 Proteins sowie mehrerer heterochromatischer DNA- und Histonmethylierungen in den Interphasekernen beobachtet werden, in den suvh2-Mutanten waren diese Modifizierungen reduziert. Die Überexpression von SUVH2 korreliert mit genomweiten Silencing-Effekten und Hypermethylation von DNA, suvh2 Mutanten zeigten im Gegensatz dazu eine Hypomethylierung der DNA ausgewählter Transgene, wobei vor allem asymmetrische Methylierungsmotive verändert waren. Somit bewirken Histonmodifizierungen durch SUVH2 Veränderungen der DNA-Methylierung.

The DNA in eukaryotic nuclei is bound to histones. The resulting nucleosomes interact with other proteins to a higher order chromatin structure. The control of transcriptionally active and inactive chromatin areas is mediated by different factors and epigenetic processes. The modification of DNA and histones can lead to local changes in chromatin structure. Histonemethyltransferases (HMTases) play a specific role in methylation of histones. A well-characterised HMTase for H3 lysine 9 is the SET-domain protein SU(VAR)3-9, a suppressor for position-effect variegation in Drosophila. The SUVH proteins in Arabidopsis thaliana are homologous to Drosophila SU(VAR)3-9. The function of most of the ten SUVH members is still unknown. Accordingly the aim of this work was the characterisation of new SUVH proteins from Arabidopsis. For that, in transient assays (Allium cepa and Scilla mischtschenkoana), the nuclear localisation and the heterochromatic association of the fusion proteins were analysed. To investigate the function of SUVH1 and SUVH2 in Arabidopsis transgenic plant lines are established. In cytological analyses SUVH1 and SUVH2 as well as the chromatin proteins from Drosophila, SU(VAR)3-9 and HP1 are found localised in the heterochromatin of Arabidopsis. Phenotypic changes in root hair morphology in SUVH1 overexpression lines, promotor GUS and RT-PCR analyses indicate for a SUVH1 function in regulation of root development. SUVH2 shows an HMTase activity in vitro and in vivo for H3 and H4. The SUVH2 overexpression leads to drastic phenotypic effects, ectopic distribution of the transgenic SUVH2 protein and some heterochromatic DNA- and histone methylation marks in interphase nuclei; in suvh2 mutants these modifications are reduced. The SUVH2 overexpression correlates with genomewide silencing effects and DNA hypermethylation, in contrast suvh2 mutants show DNA hypomethylation on selected transgenes, where mainly asymmetrical methylation motivs are affected. The histone modification by SUVH2 causes changes in DNA-methylation.

Keywords:
Arabidopsis thaliana, Heterochromatin, SUVH, Histonmethylierung, DNA-Methylierung, Gensilencing

Arabidopsis thaliana, heterochromatin, SUVH, histonmethylation, DNA-methylation, genesilencing

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Inhaltsverzeichnis
Titelblatt, Inhaltsverzeichnis, Abkürzungsverzeichnis
1. Einleitung (1-10)
2. Material und Methoden (11-32)
3. Ergebnisse (33-70)
4. Diskussion (71-85)
5. Zusammenfassung (86-87)
6. Literatur (88-98)
7. Anhang (99-102)
Publikationen (106)