Jörg Fanghänel

Untersuchungen zum Katalysemechanismus von Peptidyl-Prolyl-cis/trans-Isomerasen

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt an der Mathematisch-Naturwissenschaftlich-Technischen Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 30.06.2005

Abstract
Die Vertreter der Enzymklasse der Peptidyl Prolyl cis/trans Isomerasen (PPIasen) sind ubiquitär verbreitet und evolutionär hochkonserviert. Bis heute ist trotz einer Vielzahl von Untersuchungen weder ihre enzymologische Funktionsweise noch ihre physiologische Bedeutung ausreichend verstanden. Ziele dieser Arbeit waren zum einen, den Katalysemechanismus dieser Enzyme zu untersuchen, und zum anderen, das Methodenspektrum zu erweitern, mit welchem diese Enzyme und die von ihnen katalysierten Reaktionen untersucht werden können.
Im ersten Teil der vorliegenden Dissertationsschrift wurde die Interaktion von Inhibitoren und Substraten mit dem Protein am Beispiel der zwei prominentesten Vertreter dieser Enzymklasse, dem hPin1 und dem Cyclophilin18, kalorimetrisch charakterisiert. Die Ergebnisse in Kombination mit detaillierten Kristallstrukturvergleichen zeigten, dass der hochaffine Inhibitor Cyclosporin A im aktiven Zentrum von Cyclophilin18 als übergangsstrukturanaloge Verbindung gebunden wird. Die hochaffine Interaktion des hPin1- Inhibitors Ac-Phe-DThr(PO3H2)-Pip-Nal-Gln-NH2 beruht auf den strukturellen Gemeinsamkeiten mit den von hPin1 katalysierten Substraten, jedoch verhindern die nichtproteinogenen Aminosäureseitenketten des Inhibitors die effiziente Produktbildung.
Im zweiten Teil der Dissertationsschrift wurde mittels in vitro PPIase-Aktivitätstests die Funktionsweise der Enzyme unter steady state- Bedingungen untersucht. Dabei wurde festgestellt, dass die Katalyse der Enzyme hCyp18, hPin1 und E. coli Par10 diffusionskontrolliert verläuft, die Aktivität von hFKBP12 jedoch unabhängig von solchen Effekten ist. Alle untersuchten PPIase-Vertreter zeigten einen inversen kinetischen Lösungsmittelisotopeneffekt im Bereich von 0,52 bis 0,86. Aus den Ergebnissen der Protonen-Inventur-Experimente konnte geschlussfolgert werden, dass sich die Übergangszustände der hCyp18- und E. coli Par10-katalysierten Reaktion gleichen und sich von dem des hFKBP12 unterscheiden. Aus dem Vergleich der kinetischen und strukturellen Eigenschaften von hCyp18 und E. coli Par10 konnte weiterhin geschlussfolgert werden, dass beide Enzyme einen ähnlichen Katalysemechanismus aufweisen. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die positive Partialladung des Carbonylkohlenstoffs der Prolyl-Bindung im Übergangszustand durch ein polarisiertes Wassermolekül im aktiven Zentrum der Enzyme stabilisiert wird.
Im dritten Teil der Dissertationsschrift wird eine neue Methode beschrieben, die es ermöglicht, langsame Strukturänderungen in Proteinen und Peptiden mittels isothermer Titrationskalorimetrie zu bestimmen. Diese Methode nutzt die hohe Sensitivität und Basislinienstabilität von modernen Titrationskalorimetern aus, um die geringen Wärmemengen zu detektieren, die mit langsamen Schritten der Proteinfaltung assoziiert sind. Die Leistungsfähigkeit der beschriebenen Methode wurde anhand der langsamen cis/trans Isomerisierung von Peptidyl-Prolyl-Bindungen in Oligopeptiden sowie anhand der Rückfaltung von denaturierter RNase A überprüft. Diese Methode möglicht es, langsame Schritte der Proteinfaltung gleichzeitig sowohl kinetisch als auch thermodynamisch zu charakterisieren. Die Ergebnisse zur Rückfaltung von RNAse A zeigten überraschenderweise, dass anders als in Oligopeptiden die cis/trans Isomerisierung stark exotherm verläuft. Der Einsatz der kalorimetrischen Methode ermöglicht es, Faltungsschritte zu detektieren, die mit klassischen spektroskopischen Methoden nicht erfassbar sind, und eröffnet somit neue Möglichkeiten zur Untersuchung dieser Reaktionen.

Peptidyl prolyl cis/trans isomerases (PPIases) are ubiquitously expressed and highly conserved enzymes. Despite a great number of investigations their enzymological mode of function and their physiological relevance is so far only poorly understood. The first aim of this work was to provide additional evidence to help understanding the enzymatic mechanism of these catalysts, the second aim was to broaden the method spectrum which can be used to investigate these enzymes and their respective catalyzed reaction.
In the first part of the thesis, the interaction between inhibitors or substrates with two of the most prominent members of this enzyme class, hPin1 and Cyclophilin 18, was calorimetrically characterized. These results in combination with detailed comparisons of the available crystal structures showed that the high affinity inhibitor Cyclosporin A binds as a transition state (TS) analogue to the active site of Cyclophilin 18. The high affinity interaction between hPin1 and Ac-Phe-DThr(PO3H2)-Pip-Nal-Gln-NH2 is based on its structural similarity to hPin1 substrates, the presence of non-proteinogenic amino acid residues prevents efficient product formation
In the second part, in vitro PPIase activity assays have been employed to investigate the enzyme function under steady state conditions. It could be shown that the catalysis of the enzymes hCyp18, hPin1 and E. coli Par10 is limited by substrate diffusion and that the catalytic activity of hFKBP12 is independent of such effects. All four investigated PPIases showed an inverse kinetic solvent isotope effect in the range of 0.52 to 0.86. From proton inventory experiments it could be concluded that the reactions catalyzed by hCyp18 and E. coli Par10 have a similar TS which is different from the TS of the FKBP12-catalyzed reaction. From a comparison of kinetic and structural properties of hCyp18 and E coli Par10 the conclusion was drawn that both enzymes employ a similar enzyme mechanism. The results provide evidence that the partial positive charge located on the carbonyl carbon at the TS of the prolyl bond is stabilized by a polarized water molecule within the active centre of the enzymes.
In the third part of the dissertation, a new method is described that is capable of detecting slow structural changes in proteins and peptides by means of isothermal titration calorimetry. This method makes use of the high sensitivity and baseline stability of modern titration calorimeters to detect the small amounts of heat exchange associated with slow steps in protein folding. The method was benchmarked by measuring the slow cis/trans isomerization of peptidyl prolyl bonds in oligo peptides as well as the refolding of denatured RNase A. This calorimetric method is capable of simultaneously characterizing the kinetics and thermodynamics of slow steps in protein folding. Surprisingly, the refolding experiments of RNase A showed that in contrast to oligopeptides the prolyl cis/trans isomerization is associated with a strong exothermic reaction. It was concluded that the use of this method allows detecting folding steps which are silent if investigated by classical spectroscopic methods, and therefore opens up new possibilities to investigate such reactions.

Keywords:
Peptidyl-Prolyl-cis/trans-Isomerase, PPIase, Katalysemechanismus, ITC, Titrationskalorimetrie, Enzymkinetik, Viskosität, Isotopieeffekt, Proteinfaltung

peptidyl-prolyl-cis/trans-Isomerase, PPIase, catalytic mechanism, ITC, titration calorimetry, enzyme kinetics, viscosity, isotope effect, protein folding

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Inhaltsverzeichnis
Titelblatt, Abkürzungen, Konstanten und Symbole, Inhaltsverzeichnis (1, i-v)
1 Einleitung (1-17)
2 Ziele der Arbeit (18)
3 Material und Methoden (19-32)
4 Ergebnisse (33-70)
5 Auswertung und Diskussion (71-111)
6 Zusammenfassung (112-114)
7 Literatur (115-127)
Anhänge (128-142)
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