Hany Farwanah

Untersuchung der Ceramide des Stratum corneum in der nicht involvierten Haut bei Neurodermitis- und Psoriasis-Patienten mit Hilfe der AMD-HPTLC und der HPLC/APCI-MS

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt an der Mathematisch-Naturwissenschaftlich-Technischen Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 23.03.2005

Abstract
Ceramide sind Sphingolipide bestehend aus einer Sphingoidbase, die mit einer Fettsäure amidartig verbunden ist. Im Stratum corneum (SC), der äußersten Schicht der menschlichen Haut, sind sie unerlässlich für die Aufrechterhaltung des Lebens. Sie tragen dort maßgeblich zum Schutz des Körpers vor äußeren Schädigungen und zur Verhinderung von unkontrolliertem Wasserverlust bei. Die SC-Ceramide zeichnen sich durch ihre komplexe, einzigartige und nicht in anderen Körpergeweben anzutreffende Zusammensetzung aus, die auf vielfältigen Strukturelementen und deren Kombinationen beruht. Dadurch wird deren Analytik zu einer herausfordernden Aufgabe.
Verschiedene Hautkrankheiten gehen mit Beeinträchtigungen des Ceramidmusters im Stratum corneum einher. Zu diesen Krankheiten zählen Neurodermitis und Psoriasis, bei denen davon berichtet wurde, dass nicht nur die involvierten, d.h. geschädigten (läsionierten), sondern auch die nicht involvierten, gesund erscheinenden Hautstellen von solchen Beeinträchtigungen betroffen sind.
Das Hauptziel der vorliegenden Arbeit bestand darin, die Ceramidprofile in den nicht läsionierten Hautstellen von mit Neurodermitis und Psoriasis erkrankten Patienten mittels neuen analytischen Methoden zu untersuchen und an Hand der erhaltenen Daten zu beurteilen, ob gegebenenfalls vorhandene Differenzen einen diagnostischen Wert aufweisen. Zur Verwirklichung dieses Zieles wurde eine In-vivo-Lipidgewinnungsmethode eingeführt, die effektiv ist, die Compliance der Patienten berücksichtigt und Nachteile anderer Methoden vermeidet. Zur Trennung und Quantifizierung von SC-Ceramiden wurde eine neue automatisierte dünnschichtchromatographische Methode (AMD-HPTLC) entwickelt, die sich durch ökonomische Vorteile auszeichnet und gleichzeitig alle extrahierten Lipide und insbesondere die SC-Ceramide mit einer hohen Auflösung auftrennt. Zur Untersuchung der molekularen Zusammensetzung aller bekannten SC-Ceramidklassen wurde des Weiteren eine neue HPLC/APCI-MS-Methode entwickelt und angewandt. Diese HPLC/APCI-MS-Methode, die auf Normalphasentrennung beruht, erlaubte erstmalig alle SC-Ceramide mittels HPLC in einem Lauf zu trennen und sie sowie deren Profile gleichzeitig online zu detektieren. Außerdem war es mittels dieser Methode möglich, die für die ESI-Massenspektrometrie schwer zugänglichen veresterten Ceramide zu erfassen.
Mit den oben erwähnten Methoden wurden die Ceramidprofile in Rahm einer klinischen Studie mit einem Probandenkollektiv aus 20 Probanden (7 gesunde, 7 Neurodermitiker, 6 Psoriatiker) untersucht und verglichen. Die Auswahlkriterien waren EASI-Werte > 15 Punkte für Neurodermitiker und PASI-Werte > 20 Punkte für Psoriatiker.
Die Evaluation der Probandenuntersuchungen mit den oben genannten analytischen Methoden ergab, dass weder die Profile der Ceramidklassen (densitometrische Profile) noch die molekularen Zusammensetzungen der Ceramidspezies (massenspektrometrische Profile) in den nicht involvierten Hautarealen von Neurodermitis- oder Psoriasis-Patienten signifikante Unterschiede zu denjenigen in gesunden Probanden aufweisen. Demzufolge können die Ceramide in diesen Arealen nicht für diagnostische Zwecke herangezogen werden. Zudem lässt dieses Ergebnis davon ausgehen, dass es sich bei Neurodermitis und Psoriasis nicht um generalisierte Hautkrankheiten handelt, die alle Hautstellen in unterschiedlichen Ausprägungen betreffen. Vielmehr sind Veränderungen des Lipidmusters offenbar mehr als Folge einer durch die Krankheiten verursachten Differenzierungsstörung bzw. des Entzündungsgeschehens zu sehen.

Ceramides are sphingolipids consisting of sphingoid bases, which are amide-linked to fatty acids. In the stratum corneum (SC), which represents the outer layer of the skin, ceramides play a key role in maintaining the barrier function und protecting the skin against excessive water loss. The SC ceramides show a complex structural variability, which makes their analysis a challenge.
Various skin diseases such as atopic dermatitis and psoriasis have been reported to be related to impairments in the SC ceramide profiles, both in the involved and in the uninvolved skin.
The goal of this work was to investigate if the ceramide profiles in the uninvolved skin of atopic dermatitis and psoriasis patients are significantly different in comparison to those of healthy skin und to elucidate, whether such differences can be acquired for diagnostic purposes.
To achieve this goal, an effective in-vivo extraction procedure, which considers the compliance of the patients and avoids disadvantages of other extraction procedures, has been introduced. Furthermore, a new HPTLC method with automated multiple development (AMD) was developed and allowed a fast separation and quantification of the SC ceramides. In comparison to classical TLC procedures, the developed AMD-HPTLC method was less time and solvent consuming. In addition, a new LC/APCI-MS method enabled the separation and online detection of the molecular profiles of the known SC ceramides. With this method even esterified ceramides, which are hardly accessible to ESI mass spectrometry, could be directly detected.
Within a clinical study on 20 volunteers (7 healthy, 7 with atopic dermatitis, 6 with psoriasis), the developed analytical methods have been used to compare the ceramide profiles in the uninvolved skin of atopic dermatitis and psoriasis patients with those of healthy skin. The inclusion criteria were an Eczema Area and Severity Index (EASI) Score > 15 for atopic dermatitis patients and a Psoriasis Area and Severity Index (PASI) > 20 for psoriasis patients.

In this study no significant differences could be found, so that the uninvolved skin in both diseases can be considered "healthy". Therefore, the ceramide profiles of the uninvolved skin in both diseases cannot be used for diagnostic purposes. Instead, it seems that lipid changes are secondary effects due to a disturbed differentiation and/or inflammation processes.

Keywords:
Haut, Stratum corneum, Ceramide, Neurodermitis, Psoriasis, AMD-HPTLC, HPLC/APCI-MS

Skin, Stratum corneum, Ceramides, Atopic dermatitis, Psoriasis, AMD-HPTLC, HPLC/APCI-MS

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Inhaltsverzeichnis
Titelblatt, Inhaltsverzeichnis, Abkürzungsverzeichnis (2, 1-4)
1 Einleitung und Zielsetzung (5-7)
2 Allgemeiner Teil (8-38)
3 Experimenteller Teil (39-46)
4 Ergebnisse und Diskussion (47-82)
5 Zusammenfassung und Ausblick (83-85)
6 Literaturverzeichnis (86-100)
7 Anhang (Veröffentlichungen) (101-102)