Melkamu Getie Kebtie

Mass spectrometric characterization of elastin peptides and the effect of solar radiation on elastin

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt an der Mathematisch-Naturwissenschaftlich-Technischen Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 08.12.2005

Abstract
In diese Arbeit wurde menschliche Hautelastinpeptide charakterisiert und den Einfluss von Strahlung auf die molekulare Struktur des Elastins mittels Massenspektrometrie bestimmt. Im ersten Schritt wurde der Effekt von künstlicher Strahlung auf zwei, für die Quervernetzung des Elastins verantwortliche Aminosäuren, DES und IDE, untersucht. Dies erfolgte sowohl mit als auch ohne Zugabe von Fe2+ und H2O2, die über eine Fenton Reaktion Hydroxylradikale erzeugen. Bei den Proben, die in unterschiedlicher Weise ohne die Zugabe von Fe2+ und von H2O2 bestrahlt wurden, trat keine Änderung in der Stabilität der Aminosäuren auf. Inkubation der Aminosäuren mit Fe2+ und H2O2 oder Bestrahlung der gleichen Probe mit einer Lampe, die das Spektrum des Sonnenlichtes gut simuliert, UVA Strahlung (305-420 nm) oder UVB Strahlung (280-350 nm) führte zu einer drastischen Abnahme der Anzahl an Elastinquervernetzungen und ergab die Bildung von Abbauprodukten mit einer molaren Masse von 496 und 481. Die Behandlung der Aminosäuren mit IR-Strahlung (520 W) in Anwesenheit von Fe2+ und H2O2 beeinflusste weder ihre Menge noch führte sie zur Bildung von Abbauprodukten. Zur Charakterisierung des humanen Elastins wurden mehrere Peptide nach einem Verdau mit Elastase, Thermitase und Pepsin identifiziert. Die Sequenzabdeckung lag bei 58,8, 44,2 bzw. 48,8%. Durch Kombination der Resultate der drei Enzyme wurde eine Sequenzabdeckung von 74,1% erreicht. Im Gegensatz zu einem früher publizierten Bericht ergab die Identifizierung einiger Peptide, die von Exon 22 codierte Aminosäuren enthalten, dass dieses Exon in der mRNA des humanen Hautelastins vorhanden ist.Nach Verdau mit Pepsin bzw. Chymotrypsin betrug die Anzahl der identifizierten Peptide 100 bzw. 49, was einer Sequenzabdeckung von 86,7 bzw. 84,7% entspricht. Die gesamte Sequenzabdeckung von 94,4% wurde durch Kombination der Verdaue beider Enzyme erzielt.

In this work, human skin elastin peptides were characterized and the influence of radiation on the molecular structure of elastin was evaluated using mass spectrometry approach. In the first step of this study, the effect of radiation generated from artificial sources was studied on two elastin cross-linked amino acids, DES and IDE, in the absence or presence of Fe2+ and H2O2, which generate hydroxyl radicals by Fenton reaction. No alteration in the stability of the amino acids was observed from samples treated with all forms of radiation in the absence of Fe2+ and H2O2. Incubation of the amino acids with Fe2+ and H2O2 or irradiation of the same sample with a lamp that emits a sun-like spectrum (300 W), UVA (305-420 nm), or UVB (280-350 nm) produced a drastic decrease in the amount of the elastin cross-links and resulted in the formation of degradation products with mol. mass of 496 and 481. Irradiation of the amino acids with IR (520 W) in the presence of Fe2+ and H2O2 did not affect their amount or produce any detectable degradation product. Several peptides were identified from the elastase, thermitase and peptic digests of elastin, making the sequence coverage 58.8, 44.2 and 48.8%, respectively. The sequence coverage obtained by combining the results of the three enzymes was 74.1%. Contrary to what has been published earlier, the identification of some peptides, which share amino acids expressed from exon 22 indicate that this exon exists in the human skin elastin mRNA. A total of 100 and 49 peptides with sequence coverage of 86.7 and 84.7% were identified from the peptic and chymotrypsin digests, respectively. An overall sequence coverage of 94.4% was achieved from the digests of the two enzymes.

Keywords:
Elastin, Desmosin, Isodesmosin, Tropoelastin, Radiation, Peptidsequenzierung, Prolinhydoxylation, Haut, Massspektrometer

Elastin, Desmosine, Isodesmosine, Tropoelastin, Radiation, Peptide sequencing, Proline hydroxylation, Skin, Mass spectrometry

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Inhaltsverzeichnis
Title page, table of contents, abbreviations (I-VI)
1. Introduction (1-3)
2. Background (4-28)
3. Results and discussion (29-47)
4. Summary (48-53)
5. References (54-63)
6. Appendix (List of Publications) (64-69, ff.)